南方鲇生长激素完整cDNA的克隆及其DNA序列分析

采用RT-PCR法和3'、5'RACE(Rapid amplification of cDNA ends）法从南方鲇脑垂体RNA克隆出生长激素(Growth hormone,GH）cDNA。此cDNA全长1087nt(含Rloy(A)),其5'端非编码区长52nt、阅读框（Open rdading frame,ORF）长603nt、3'端非编码区长415nt。其推导的GH由200个氨基酸组成,其中前24个氨基酸为信号肽部分。氨基酸序列比较表明,南方鲇（GH）与Pangasianodon gigas、Ictalurus punctatus 和Heteropneustes fossilis三种鲇类的同源性分别为97.5%和95.0%,与鲢、鳙、草、鲤鱼的GH同源性达76.0%以上,而与人的GH(I、Ⅱ)同源性最低为31.0%和29.5%。     

豚鼠生长激素受体cDNA的克隆

报道了豚鼠肝生长激素受体（ＧＨＲ）的ｃＲＮＡ克隆和编码区序列。它由１８９９ｂｐ组成,编码６１０个氨基酸。此外,还报道豚鼠ＧＨＲ的结构特征和同源性比较的结果。     

大熊猫生长激素受体(GHR)cDNA的克隆与序列分析

根据已报道的若干物种GHR 基因cDNA 序列设计引物, 利用RT- PCR 技术首次从大熊猫肝脏组织总RNA中扩增出GHR 基因编码区全长cDNA 序列, 克隆于pGEM®-T 载体后进行测序和序列分析。结果表明,大熊猫GHR 的ORF为1 917 bp , 编码638 个氨基酸的前体蛋白, 由18 个氨基酸的信号肽和620 个氨基酸的成熟肽组成,与人、狗、猪GHR 结构相似, 大熊猫GHR 成熟肽由246 个氨基酸的胞外区、24 个氨基酸的跨膜区和350 个氨基酸的胞内区组成, 并具GHR 的特征性结构。序列相似性比较显示, 大熊猫GHR 与哺乳类GHR 具有69 %～93 %的高序列相似性, 与爬行类和鸟类的序列相似性也达到60 % , 而与鱼类的序列相似性较低, 仅为30 %左右。与其它哺乳动物GHR 相比, 大熊猫GHR 在氨基酸序列上也存在明显的特异性。     

6种重要经济鱼类生长激素完整cDNA的克隆和序列分析

通过RT-PCR、3′RACE、5′-RACE方法,从6种重要经济鱼类——大眼鳜(Siniperca kneri)、石斑鱼(Epinephelus coioides)、黄鳝(Monopterus albus)、鲶鱼(Silurus asotus)、泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)和方正银鲫(Carassius auratus gibelio Bloch,Fang Zheng crucian carp)中克隆了生长激素(Growth Hormone,GH)的完整cDNA序列(除石斑鱼序列外,其他生长激素序列均系第一次克隆),并详细分析了其序列特征。测序结果显示,克隆的6种GH cDNA长度依次为953bp、1023bp、825bp、1082bp、1154bp和1180bp,它们均包含一个长度为600个左右核苷酸的完整阅读框,分别编码一个200个左右氨基酸的蛋白：大眼鳜、石斑鱼和黄鳝GH为204个氨基酸,鲶鱼GH为200个氨基酸,泥鳅和方正银鲫GH为210个氨基酸。这6种蛋白序列与其他已知的鱼类GH序列都有较高的同源性,特别是与相同目的鱼类序列相比。通过序列比对,在这些蛋白序列内鉴定了许多保守的氨基酸残基,其中的大多数聚集而成5个保守域。基于这6种鱼类序列的编码区和其他鱼类的GH编码序列进行分子系统学分析,结果(MP和NJ树)与根据形态特征构建的系统发育树基本一致,特别是在硬骨鱼类较大分类阶元(目间、目以上)的系统发育研究方面比较一致,尽管仍存在一定差异,说明生长激素基因的编码区应该在硬骨鱼类系统发育研究领域得到更多的重视。     

大麻哈鱼生长激素基因Ⅱ的分子克隆和序列分析

以λ噬菌体ＥＭＢＬ－３为基因载体,构建大麻哈鱼（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ　ｋｅｔａ）基因组文库,并从中分离出含全长的生长激素（ｃｓＧＨ）基因的克隆。本研究首次报道了对ｃｓＧＨ全长核苷酸序列分析的结果。发现ｃｓＧＨ基因由６个外显子和５个内含子组成,长度为３３６１碱基对（ｂｐ）。由该序列可推导出含２１０个氨基酸的多肽,其中存在２２个疏水氨基酸残基的信号肽。本研究所分析的ｃｓＧＨ的外显子和内含子,其排列方式与其他鲑类（Ｓａｌｍｏｎｉｄｓ）和罗非鱼（Ｔｉｌａｐｉａ）是相似的,而与鲤科鱼类（Ｃａｒｐｓ）不同,后者外显子和内含子的排列方式与哺乳类和鸟类相似。将所测定的 ｃｓＧＨ基因的编码区与已发表的 ｃｓＧＨⅡ和ｃｓＧＨ Ⅱ两种 ｃＤＮＡ序列进行比较,证明本研究所克隆的 ｃｓＧＨ基因应属于 ｃｓＧＨ Ⅱ,因它们的编码序列 １００％同源。     

鲤鱼生长激素基因的PCR扩增、克隆及其序列比较

从鲤鱼(Cyprinus carpio)脑垂体中分离其总RNA,经反转录成为第一条链cDNA。以第一条链cDNA为模板,以合成的两段29个寡聚核苷酸为引物,再经过PCR扩增,合成了鲤鱼的生长激素基因,并把其克隆到大肠杆菌表达载体(P^{blue-ocripx Ks+/-})上。序列分析和限制酶切图谱表明所克隆的鲤鱼生长激素基因的开放读框含有630bp,编码210个氨基酸,其中含有22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟GH序列。我们所克隆的鲤鱼GH基因与Koren发表的鲤鱼GHcDNA的序列在编码区完全一致,但是与chao发表的鲤鱼GHcDNA比较,在编码区核酸序列和氨基酸序列的同源性分别为95．6％和96．7％。     

青鱼生长激素的重组表达及其多克隆抗体的制备

以含有的青鱼生长激素编码区cDNA的重组质粒pbcGHc为模板,高保真PCR扩增青鱼生长激素（GH）成熟肽cDNA序列,定向插入原核表达载体pET-28a,构建青鱼GH原核表达质粒pET-bcGH。将pET-bcGH转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导青鱼GH基因在大肠杆菌中的融合表达,SDS-PAGE凝胶电泳结果显示一条23 kDa的诱导表达重组青鱼GH带。以草鱼GH多克隆抗体为一抗,Western Blot证明,该重组青鱼GH具有免疫学活性。将经过亲和层析、透析纯化后的重组青鱼GH作为抗原,采用改进的方法对家兔进行皮下免疫注射,获得青鱼GH多克隆抗血清。以该多抗为一抗,Western Blot 可以检测出4 ng的抗原量;并且在青鱼垂体组织抽提液中和血清中检测到一种能与该抗血清作用的大小为21 kDa的蛋白质。这些结果表明本研究得到的青鱼GH多克隆抗血清具有较好的免疫特性。     

人生长素基因的合成及克隆

根据人生长素基因的氨基酸序列,选择大肠杆菌所偏好的密码子,人工设计并合成了20个寡核苷酸片断。通过重叠区扩增法,利用PCR成功地合成了人生长激素基因的全序列。经克隆测序,证明已成功地实现了人生长素基因的合成及克隆。     

青鱼逃逸过程中的疾冲-滑行游泳行为

本实验以青鱼（Mylopharyngodon piceus）为研究对象,定性分析了通过电击实验鱼受到惊吓而产生的快速逃逸游泳行为,并定量分析了其疾冲游泳过程中加速度、最大疾冲游泳加速度和减速过程中的加速度。在自然光照下,保持实验水温为（20.0±1.0）℃。青鱼的3种不同体长规格分别为稚鱼（9.21±1.89）cm（n=30）、幼鱼（17.83±2.67）cm（n=30）和亚成体（61.45±0.80）cm（n=10）。实验过程中发现实验鱼逃逸游泳行为主要以疾冲-滑行的游泳方式进行,即实验鱼到达最大疾冲速度后身体保持固定直线不变的形式减速。3种实验体长的青鱼,其对应的最大绝对逃逸速度分别为（1.261±0.279）m/s、（1.542±0.280）m/s和（2.292±0.567）m/s,到达最大逃逸速度的时间分别为（0.249±0.089）s、（0.293±0.067）s和(0.216±0.024) s,对应的最大相对逃逸速度（实验鱼每秒内游泳距离相对于体长的倍数）分别为（13.694±3.032）BL/s、（8.648±1.571）BL/s和（3.729±0.923）BL/s。单因素方差分析表明,实验鱼的绝对疾冲速度随体长的增加而增加,亚成体的最大疾冲游泳速度显著大于稚鱼（P<0.05）;相对疾冲速度随体长的增加而减小,3种实验鱼之间的最大相对疾冲游泳速度均存在显著性差异（P<0.05）;亚成体的绝对滑行游泳加速度的绝对值显著高于幼鱼和稚鱼(P<0.05）。3种实验鱼之间的相对滑行加速度不存在显著性差异（P>0.05）。     

鲤鱼生长激素基因的改造及其在大肠杆菌中的表达

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）改造了锂鱼生长激素基因,扩增出编码锂鱼生长激素成熟肽的序列,并将此序列克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ⅱ ＫＳ质粒中,序列分析后,亚克隆到大肠杆菌表达载体ｐＢＶ２２０中。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层扫描,结果表明锂鱼生长激素基因已大肠杆菌中获得表达。锂鱼生长激素成熟肽的分子量为２２０００道尔顿,表达率占细胞总蛋白的１８％以上％。     

青鱼微卫星标记的开发与特性分析

青鱼(Mylopharyngodon piceus)是中国最为重要的淡水养殖鱼类。开发青鱼的微卫星标记能为青鱼的遗传多样性分析提供更多工具。本研究使用磁珠富集法,利用生物素探针(CA)10和(GACA)6,富集得到青鱼基因组微卫星片段,进一步通过设计微卫星引物检验其在青鱼原种群体中的有效性和多态性水平。结果显示,所构建文库中849个克隆含有微卫星序列,通过利用PCR技术在吴江原种青鱼36个个体中进行多态性筛选,获得了25个多态性微卫星位点。其平均等位基因数(Na)和有效等位基因数(Ne)分别为7.08和3.526,平均观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别为0.602和0.619,平均多态信息含量(PIC)为0.568。其中,Mp23、Mp27和Mp35这3个位点极显著偏离哈迪-温伯格平衡(P 0.01)。本研究开发的微卫星标记能为青鱼种质资源的评价和保护等研究提供工具。     

川金丝猴垂体生长激素基因的克隆与初步分析

本研究通过PCR克隆测序,初步确定了川金丝猴(Rhinopithecus roxellanae)的垂体生长激素基因的全部外显子核苷酸序列及推断出相应的氨基酸序列（包括26个氨基酸的信号肽序列以及191个氨基酸的成熟蛋白序列）。我们构建了灵长类7个物种垂体生长激素基因进化关系的基因树。垂体生长激素氨基酸序列的比较和垂体生长激素重要功能位点分析的结果显示：猴科的猕猴与疣猴科的川金丝猴垂体生长激素基因差异非常小。我们推测在猴超科动物中,垂体生长激素无明显功能上的差异。 Abstract:Putative pituitary growth hormone gene of Rhinopithecus roxellanae was cloned and sequenced.All exons sequences and deduced amino acid sequence (containing 26 residues signal peptide and 191 residues mature protein) were obtained.We constructed a phylogenetic tree,which well reflected the true evolutionary relationship of pituitary growth hormone genes from 7 primates species.From the results of amino acids sequence comparison and analysis of functionally important sites of growth hormone,pituitary growth hormone of macaque from Cercopithecidae and snub-nosed golden monkey from Colobidae show little difference.We indicated that pituitary growth hormone from Cercopithecoidea species have no apparently functional difference.     

猪生长激素cDNA的分子克隆

用改进的氯化锂沉淀沉法和寡聚(dT)一纤维素亲和层析法由猪垂体制得总mRNA。以此总mRNA为模板,合成cDNA。钝端连接重组到质粒pUC19的SmaI位点,转化E.coli JM107,筛选出阳性克隆。用限制性内切酶酶切签定及5’端部分核苷酸序列分析证明:克隆了全长猪生长激素cDNA,其长度约为896bp。     

肠溶微囊式重组鲤生长激素促生长剂的研制

采用草鱼生长激素夹心式酶联免疫吸附测定法和酶联免疫吸附受体测定法,研制肠溶微囊式重组鲤生长激素（rcGH)促生长剂,结果表明,肠溶树脂Ⅰ和Ⅱ溶解的pH阈值分别为6.0和6.6,当大于阈值时,肠溶微囊Ⅰ和Ⅱ内rcGH的释放率随pH值升高和时间延长而逐渐升高,直至rcGH完全释放,投喂胡子鲶（Clarias batra-chus)含肠溶微囊Ⅰ（内含rcGH0后,血清rcGH水平15h后开始升高,24h时达最大值,随后呈下降趋势,48h后血清中检测不到rcGH;而投喂含rcGH的药饵（1mgrcGH/g饵料）,6-60h在胡子鲶血清中均未检测到rcGH。说明肠溶微囊Ⅰ对rcGH起一定保护作用,肠溶微囊Ⅰ和Ⅱ具有抗酸肠溶胶囊的特点和作用。