H9N2亚型AIVHA基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank公开发表的禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus,AIV)H9N2亚型血凝素基因(HA)序列设计引物,用PCR方法从重组质粒pUCHA中扩增H9N2亚型禽流感病毒去除信号肽的血凝素基因,将该片段定向插入到原核表达载体pET32a(+)中,构建原核表达载体pETHA。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导,HA基因获得表达,经定位分析,目的蛋白以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变IPTG的浓度和诱导时间,确定了表达HA基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.7mmol/L,诱导时间为3h。Westernblot分析表明,重组蛋白能与H9N2亚型AIV阳性血清发生特异性反应。以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板建立了检测H9亚型AIV抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原的最佳包被浓度为25μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:OD待检血清>0.5且OD标准阳性血清>1.0;OD标准阴性血清<0.1。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因的原核表达及间接ELISA方法的初步建立

根据GenBank公布的H5N1亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因序列设计引物,用PCR方法扩增H5N1亚型禽流感病毒HA1基因, 将该片段定向插入到原核表达载体pET_32a(+)中,构建原核表达载体pET_HA1。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3), 经IPTG诱导, HA1基因获得表达, 重组蛋白以包涵体的形式存在。通过改变IPTG的浓度和诱导时间 , 确定了表达HA1基因的最佳诱导条件: IPTG终浓度为0.8mmol/L,诱导时间为3h。Western blot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。以纯化的表达产物作为诊断抗原建立了检测H5亚型AIV抗体的iHA_ELISA方法。结果表明,抗原的最佳包被浓度为4μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶200, 阳性标准初步定为：OD待检血清＞05,且 OD待检血清/OD阴性血清＞2。     

禽流感病毒H7N2血凝素HA1基因在大肠杆菌中的表达

目的　表达H7N2亚型禽流感病毒 (AIV)HA1基因 ,用于感染H7亚型禽流感病毒抗体的检测和HA1蛋白功能研究。方法　采用RT PCR方法对H7N2亚型AIVHA1基因进行扩增 ,将PCR产物克隆于pGEM T Easy载体 ,将该基因插入pGEX 4T 2中构建HA1基因原核表达载体 ,转化BL2 1大肠杆菌后 ,在IPTG诱导下表达HA1蛋白 ,Westernblot鉴定表达HA1蛋白。电洗脱方法纯化表达HA1蛋白 ,建立间接ELISA方法 ,对感染AIVH7、H9、H5亚型AIV阳性血清进行检测。结果　成功克隆H7N2亚型AIV的HA1基因 ,其核苷酸序列长度 96 6bp ,编码 32 2个氨基酸残基。构建HA1基因原核表达载体在大肠杆菌内表达出约 6 1× 10 3的HA1融合蛋白。Westernblot和ELISA方法鉴定表明 :表达HA1蛋白与感染H7亚型AIV鸡血清有反应 ,与H5、H9亚型AIV阳性血清没有反应。结论　本研究在大肠杆菌中成功表达了H7N2亚型AIVHA1基因蛋白 ,具有与感染H7亚型AIV阳性血清反应原性 ,不与H5和H9亚型AIV感染阳性血清发生反应。     

H9N2亚型禽流感病毒M2e和HA2串联蛋白在原核系统中的表达

构建H9N2亚型禽流感病毒M2蛋白胞外区(M2e)和HA蛋白颈部区(HA2)串联体,并在原核系统中进行该重组蛋白的表达,以便研究重组蛋白的反应原性。以含有全长H9N2亚型AIV HA基因的质粒为模板,经过PCR扩增得到HA2基因;利用BglⅡ和Bam HⅠ互为同尾酶的链接方法,构建3个拷贝M2e和HA2基因的串联体,并将串联体连接入原核表达载体pGEX-4T-1构成3M2e+HA2-pGEX重组质粒;同时构建单独表达HA2蛋白的原核表达重组质粒HA2-pGEX;DNA测序鉴定这两种重组质粒正确后,转化至表达宿主菌中;重组蛋白经不同IPTG浓度进行诱导;SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白大小,并进行可溶性分析和纯化;采用Western blotting法对两种重组蛋白的反应原性进行分析。结果显示,3M2e+HA2-pGEX和HA2-pGEX重组蛋白分别经终浓度为0.5 mmol/L和0.25 mmol/L的IPTG诱导,37℃培养4 h时,表达量最高;3M2e+HA2-pGEX和HA2-pGEX重组蛋白大小分别为59.4 ku和49.8 ku;对重组蛋白进行可溶性分析显示,两种重组蛋白均以包涵体形式存在;Western blotting分析显示,3M2e+HA2-pGEX和HA2-pGEX重组蛋白与免疫H9N2禽流感病毒后获得的阳性血清具有良好的特异性反应,这些结果为进一步研究HA2、3M2e+HA2蛋白的免疫原性和开发广谱H9N2亚型禽流感疫苗提供了理论依据。     

禽流感血凝素基因的原核表达及其在H9亚型诊断中的应用

根据H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因序列设计并合成引物 ,从本室分离并保存的H9N2亚型禽流感病毒中扩增了预计约 16 83bp的血凝素基因 ,将此扩增产物克隆进pMD18-T载体 ,限制性酶切及序列测定后 ,进一步将其亚克隆到pGEX-KG中 ,与GST蛋白融合表达。SDS-PAGE和Western印迹表明缺失信号肽后的HA基因在大肠杆菌中获得了表达 ,表达产物具有免疫学活性 ,融合蛋白的分子量约为 90kD,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理 ,利用复性产物作为抗原包被酶标板建立了检测H9亚型禽流感抗体ELISA方法。结果表明应用HA重组蛋白作为诊断H9亚型禽流感抗原具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点 ,可用于H9亚型禽流感抗体的检测。     

禽流感病毒H5N1亚型NS1基因在大肠杆菌中的表达

目的表达H5N1亚型禽流感病毒(AIV)NS1蛋白,用于AIV感染与注射灭活疫苗鸡的鉴别诊断和NS1蛋白功能研究。方法采用RT_PCR方法对H5N1亚型AIVNS1基因进行扩增,将PCR产物克隆于pGEM_T_easy载体,将该基因插入pGEX_4T_1中构建NS1基因原核表达载体,转化BL21大肠杆菌后,在IPTG诱导下表达NS1蛋白,Westernblot鉴定表达NS1蛋白。结果成功克隆H5N1亚型AIV的NS1基因,其核苷酸序列长度为690bp,编码230个氨基酸残基。构建NS1基因原核表达载体在大肠杆菌内表达出约51×103的NS1融合蛋白。Westernblot鉴定表明表达NS1蛋白与H7N2AIV感染鸡血清有反应性。结论在大肠杆菌中成功表达了H5N1亚型AIVNS1基因蛋白,具有与感染H7N2亚型AIV阳性血清反应原性。     

猪细小病毒VP2蛋白的主要抗原表位基因的原核表达及检测应用

将构建好的重组质粒PET-VP2Ⅰ转化宿主菌BL21,利用IPTG(1mmol/L)诱导实现了PET-VP2 Ⅰ蛋白主要抗原域VP2 Ⅰ融合蛋白的高效表达.通过Western-blot检测证明表达的重组蛋白具有良好的免疫学活性.表达产物经HisBind层析柱纯化后作为诊断抗原初步建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法.结果表明抗原的最佳包被浓度为3.5μg/mL,血清的最佳稀释度为140,待检血清阳性标准初步定为OD490＞0.51,且待检血清的OD490值与阴性血清的OD490值的比值大于2.1.     

H5亚型禽流感病毒单抗-生物素捕获ELISA的建立

目的建立一种单克隆抗体介导的、经生物素—亲和素系统放大的H5亚型禽流感病毒捕获ELISA检测方法,为进一步研究检测试剂盒提供基础。方法用亲和层析法纯化抗禽流感病毒H5亚型血凝素单克隆抗体,包被微量反应板,用于捕获病毒抗原,再用生物素标记的单抗和酶标亲和素来检测病毒血凝素抗原,经方阵试验优化ELISA反应体系。用该方法检测H1—H15亚型AIV标准毒株和H5、H7、H9亚型AIV分离株,并与血凝和血凝抑制试验比较,评价其敏感性和特异性。结果纯化后的单抗具有良好的反应活性,生物素标记单抗工作浓度为1∶5000;ELISA对H5亚型AIV的检出限为025个血凝单位。该ELISA反应体系能检出H5N3标准株和所有20株国内H5亚型AIV分离株,而与其他14个血凝素亚型的AIV标准株、15个H9亚型AIV分离株和2个H7亚型AIV分离株均无交叉反应。结论初步建立了检测H5亚型禽流感病毒的单抗—生物素捕获ELISA方法,为研制试剂盒和进一步应用试验提供了基础。     

H5N1亚型AIVHA抗原表位的高效表达及其抗原活性分析

血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白是禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的一个重要表面抗原性蛋白,在疾病诊断和防治上有重要意义。本研究为了探讨一种更为简便有效的HA重组蛋白表达途径,利用生物信息学软件,对H5N1亚型AIVHA基因编码的氨基酸序列进行分析,在分析其在大肠杆菌中的密码子偏好性、稀有密码子分布情况及有关蛋白的抗原性等重要特性后,构建了HA抗原表位重组表达质粒pET-32a(+)-HA。经测试,该重组质粒在1mmol/LIPTG诱导剂作用下诱导过夜,能在大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)中高效表达,并得到48.1kD大小的目的重组表达蛋白。重组蛋白用6×His-tagged protein纯化试剂盒纯化后,与福氏佐剂等量混合制备成抗原,以200μg/鸡的剂量皮下注射2月龄SPF鸡3次,采血分离血清。Western-Blot试验结果表明,该重组表达蛋白能分别与所制备的高免鸡血清及H5N1亚型AIV阳性血清发生特异性反应,在硝酸纤维素膜上出现特异性杂交带。说明本试验研究的HA抗原重组表达蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,保留了HA蛋白的抗原活性,提示该重组蛋白在H5亚型AIV的防治技术研究中具有重要的实际应用价值。     

鸭源H9N2AIV血凝素基因序列比较

为明确国内外鸭源H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)血凝素基因(hemagglutinin,HA)的遗传进化关系、血凝素蛋白裂解位点的氨基酸结构特征和血凝素蛋白受体结合位点的氨基酸变异特征,本研究选取GenBank中登录鸭源H9N2亚型AIV HA基因,通过MEGA4.1进行比对和分析,并绘制其遗传进化树。结果表明,鸭源H9N2亚型AIV在遗传进化上分为2大谱系:即Ck-Bj-1-94-like和North-Ame-like,中国大陆鸭源H9N2亚型AIV和亚欧美其它国家鸭源H9N2亚型AIV在遗传进化上分居完全不同的谱系,相互之间遗传进化关系较远。从血凝素受体结合位点看,亚欧美国家鸭源H9N2亚型AIV在第183、190和226位点的氨基酸均为鸭源AIV经典H、E和Q,且高度保守。但中国大陆地区H9N2亚型AIV第183位为N;第190位为A or V or T,与中国大陆鸡源H9N2亚型AIV一致;第226位中国鸭源H9N2亚型AIV有相当一部分为L,且近年福建省H9N2亚型AIV分离株在此处均为L。提示我们,中国大陆地区H9N2亚型AIV鸭鸡和鸡鸭相互交叉感染较为普遍。     

Topography of the contours of the inner surface of the wall of the left ventricle of the heart in systole

Chosen at random 38 diastolic preparations of human hearts from persons having not any cardiac pathology, as demonstrate the postmortem examination, have been investigated. The left ventricle casts have been made during the first 24 hours after death according to a strictly fixed technique by means of filling the cardiac chambers with polymere mass--protacryl--under a physiological pressure of the diastolic filling. The trabecules are arranged as a spiral from the apex of the ventricle up to the atrioventricular fibrous ring, with approaching the apex the spiral step increases and the trabecules straighten. The left ventricle cast is devided into some planes, the envelopes and the trabecularity lines are measured. Average values of the shift in the trabecularity lines I, II, III and in the cross sections B, C, D, E are defined in relation to the plane A and in every case in relation to the previous plane Cn-1. The data obtained are presented in tables and diagrams. The greatest shift demonstrate the trabecularity lines I running predominantly along the posterior wall of the left ventricle in the planes B and which are situated nearer to the atrioventricular ring projection. Owing to the presence of the spiral-shaped course of the trabecules, it is possible to suppose that it influences the blood stream twisting clockwise in the left ventricle during the diastole phase. This indicates the necessity to work out some new constructions of artificial cardiac valves, securing the twisted blood stream. The condition mentioned should be taken into consideration while making prostheses of the cardiac valves.