怒江上游三种裂腹鱼类摄食及消化器官比较研究

于2017年5和6月以及9和10月在怒江西藏段收集了怒江裂腹鱼(Schizothorax nukiangensis)194尾、裸腹叶须鱼(Ptychobarbus kaznakovi)152尾,热裸裂尻鱼(Schizopygopsis thermalis)117尾。综合运用3种多元分析方法分析3种鱼类摄食及消化器官形态的种间差异,结果显示,主要种间差异部位为头部及肠道;种间形态指标均为显著性差异(P <0.05);3种裂腹鱼的头部形态已有了一定程度的分化。鱼类食物组成及食物竞争情况研究表明,怒江裂腹鱼和裸腹叶须鱼属杂食性偏动物食性鱼类,两者食物重叠指数较高(0.91);热裸裂尻鱼属杂食性偏植物食性鱼类。食物多样性指数的种间差异明显。3种裂腹鱼营养及空间生态位均有分化,摄食与水温、流速和海拔等环境因素密切相关。     

基于微流控技术的外泌体分离方法的研究进展

外泌体是一种由细胞分泌的,直径一般为30-150 nm的囊泡。外泌体携带有多种蛋白质、mRNA及miRNA等生物标记物,并直接参与细胞间的信息传递、抗原传递、蛋白转运以及RNA转录等重要的生命活动过程,与癌症等多种疾病的发生密切相关,因此在疾病的发生机制探索和相关疾病的检测中具有重大的应用价值。然而,外泌体通常以游离的形式存在于体液中,对外泌体的分离和纯化是实现基于外泌体的疾病发生机制及疾病检测应用研究的基础。近年来,研究人员利用外泌体的生物物理和生物化学性质研发了多种分离和纯化外泌体的方法技术,主要有超速离心法、聚合物沉淀法、免疫分离法以及基于微流控的分离法等。综述了近年来外泌体分离和纯化方法的研究进展,简要论述了传统的外泌体分离方法,重点介绍了基于微流控技术的外泌体分离方法,并比较了这些方法的分离机制、优缺点以及应用前景。通过对近年来外泌体分离和纯化方法的研究现状进行归纳和比较,旨为相关研究人员开展外泌体研究工作提供参考,从而进一步推进外泌体在疾病检测及其他生物医学应用的研究进展。     

海分枝杆菌-斑马鱼模型的抗结核研究进展

斑马鱼(Danio rerio,Zebrafish)模型是研究宿主-病原体相互作用的有力平台。因为其光学透明特性,斑马鱼幼虫感染模型有利于探索在活脊椎动物体内实时观察海洋分枝杆菌(Mycobacterium marinum, M. marinum)感染的早期阶段的发病机制。此外,斑马鱼幼虫免疫系统提供了探索海洋分枝杆菌与宿主免疫作用机制的条件。还因斑马鱼发育周期短、繁殖产量高、饲养条件低而备受欢迎,而海分枝杆菌因其实验环境要求低,基因相似性与结核分枝杆菌高而作为研究结核的备选细菌。因此,斑马鱼-海分枝杆菌感染模型的使用成为揭示结核病发病机制并研发药物的有效途径之一。     

斑马鱼脾显微与超微结构

应用光学显微镜和透射电镜对斑马鱼(Daniorerio)脾的显微与超微结构进行了观察。光镜结果表明,斑马鱼的脾主要由脾髓和网状组织两部分构成,脾髓分布于整个脾,分为白髓和红髓,但界限不明显,呈混合分布。红髓染色相对较浅,占脾实质的大部分区域,主要由密集的红细胞构成,可见脾窦结构,脾索结构不明显。白髓染色较深,主要由密集的淋巴细胞构成,淋巴细胞的胞核染色较深,呈深紫色。经Gordon-Sweet银染显示网状纤维后,可清晰观察到脾小结,从而可清晰区分红髓与白髓,脾小结与哺乳动物的类似,主要是由密集的淋巴细胞构成。酸性磷酸酶染色可见斑马鱼脾内有大量吞噬性细胞存在。电镜结果显示,红髓分布有不同类型的红细胞、血小板和浆细胞,白髓分布有淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、浆细胞和网状细胞,淋巴细胞胞质内含有多泡体,这可能与淋巴细胞发挥免疫功能有着密切联系。斑马鱼脾与大多数硬骨鱼相似,未观察到椭球这一特殊结构。     

利用CRISPR-Cas9敲除Tyr基因制作白化C57BL/6N小鼠

目的 为了获得白化的C57BL/6N小鼠,扩大其在皮肤移植和胚胎干细胞方面研究中的应用。方法 通过体外设计合成Cas9 mRNA和系列sgRNA(single guide RNAs),注射到小鼠的受精卵内,破坏合成C57BL/6N小鼠黑色素生成必须的酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)基因序列的第1和第2外显子,产生基因突变,获得F0代白化的C57BL/6N小鼠,然后经过重复回交和自交,形成白化C57BL/6N小鼠近交系。结果 经过注射两对sgRNA,成功的获得了F0代的白化小鼠,在Tyr基因的第1和第2外显子中均发生了缺失突变,小鼠可以将突变基因传递给后代,并在其后代中产生了纯合的白色C57BL/6N小鼠,最后对白化小鼠突变类型进行了分析。结论 通过CRISPR-Cas9技术破坏了小鼠Tyr基因,成功地建立了白化C57BL/6N小鼠近交系,为将来的嵌合体制作、组织移植提供了新的研究工具。     

MDCK细胞宿主蛋白含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的建立检测犬肾细胞(madin-darby canine kidney, MDCK)宿主细胞蛋白(host cell protein, HCP)含量的双抗体夹心ELISA。方法从MDCK细胞中提取细胞总蛋白,免疫新西兰兔制备兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体,抗体经辛酸-硫酸铵沉淀和Protein A层析纯化后,采用SDS-PAGE分析抗体纯度,Western blot检测抗体特异性。用纯化的多克隆抗体作为包被抗体,并采用改良过碘酸钠标记法制备酶标抗体,建立ELISA并确定包被抗体浓度和辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体稀释度等最适条件。确定该方法较佳的线性范围及检测限,并对该法特异性、准确度、精密性和重复性进行验证。最后,用该方法分别对接种流感病毒的MDCK细胞上清收获液和纯化样品进行MDCK细胞蛋白含量检测,初步验证其在纯化工艺开发中的适用性。结果通过免疫新西兰兔制备了高滴度的兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体血清,滴度可达1∶8 000。纯化后的兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体纯度>90%,并可与MDCK细胞蛋白特异性结合。建立的双抗体夹心ELISA的理想包被抗体质量浓度为10μg/mL,酶标抗体的工作浓度为1∶500稀释。该方法的线性范围为50~2 500 ng/mL,检测限为50 ng/mL;该方法对Vero细胞、293T细胞和Mrc-5细胞等其他细胞HCP无交叉反应,特异性良好;不同浓度的MDCK细胞HCP回收率在98.5%~111.9%之间,变异系数均<10%。接种流感病毒的MDCK细胞培养上清经多步纯化后MDCK细胞蛋白质量浓度逐渐降低至<900 ng/mL,纯化工艺可有效去除MDCK细胞蛋白残留。结论建立双抗体夹心ELISA检测MDCK细胞残余HCP含量的方法,可用于基于MDCK细胞培养的流感疫苗下游工艺开发中宿主细胞残留HCP含量监测。     

灵芝酸A对前列腺癌LNCaP细胞的生长抑制作用及机制

本研究利用alamarBlue~?测定细胞活力法、流式细胞术(annxin V-FITC)/PI双染色测定细胞凋亡法和高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)测定5α-还原酶活性法评价灵芝酸A对前列腺癌的体外抗肿瘤活性,并进一步利用流式细胞术2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯(2’,7’-dichlorofluorescindiacetate,H2DCFDA)染色测定ROS释放量法、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)和蛋白质免疫印迹(western blot,WB)检测雄激素受体(androgen receptor,AR)基因和凋亡相关基因表达的方法,探讨其作用机理。研究结果表明灵芝酸A可通过抑制5α-还原酶活性,抑制睾酮诱导的前列腺癌LNCaP细胞增殖,诱发细胞早期凋亡来发挥抗肿瘤活性;进一步研究表明,灵芝酸A降低前列腺癌细胞中AR的表达,并通过引发细胞线粒体功能障碍释放过量活性氧(reactive oxygen species,ROS)诱发细胞凋亡,而qPCR和WB的数据进一步表明细胞线粒体功能障碍与抑癌基因caspase-3、bad和aifm1的高表达密切相关。     

湖北黄石典型水域超微型真核浮游生物多样性研究

为探讨湖北省黄石市典型水域中超微型真核浮游生物多样性,采用18SrDNA扩增片段限制性酶切技术,结合优势类群测序及相关统计学分析,对2015年夏季湖北黄石境内营养程度不同的典型水域(长江,磁湖,青山湖,青港湖)中超微型真核浮游生物的群落组成及遗传多样性进行了研究。结果表明,4个水域的超微型真核浮游生物多样性有明显差异,多样性随水域营养化程度的增高而降低。优势克隆的测序结果显示,优势类群藻类包括隐藻、绿藻、甲藻,真菌包括隐真菌和壶菌,此外还有纤毛虫及未分类的浮游生物,隐藻在4个水域中都占优势。不同水域的优势类群差别较大。优势类群的种类随水域营养化程度的增加而减少。群落的多样性与总磷呈极显著的负相关。     

丹江口库区湖北水源区不同密度马尾松人工林水源涵养能力

为了研究南水北调中线水源区汛期森林的水源涵养功能,以丹江口库区龙口林场马尾松人工林为对象,于2018年6-9月采用野外观测与室内分析相结合的方法,对高、中、低3种密度马尾松人工林,从林冠层、枯枝落叶层和土壤层进行分析,探究其丰水期水源涵养功能的林分密度效应.结果表明:(1)3种密度马尾松人工林林冠截留量为56.13~77.68 mm,且随林分密度增加林冠截留量增大,林内穿透雨量则趋势相反;(2)3种密度马尾松人工林枯落物总生物量为12.76~19.56 t·hm^-2,随着林分密度增加枯落物总生物量增大,且半分解层枯落物生物量均大于未分解层枯落物生物量;高密度枯落物总厚度最大,中密度次之,低密度最小;枯落物最大持水量为21.32~28.24 mm,有效持水量为16.82~22.51mm,且均表现为中密度>高密度>低密度;枯落物持水量、吸水速率与浸泡时间分别呈对数函数和幂函数关系式;(3)3种密度马尾松人工林O~ 30 cm土层土壤容重为1.45~ 1.54g·cm^-3,总孔隙度均值为42.18%~45.71%,土壤有效持水量为2.94~4.81 mm,且土壤容重大小为低密度>高密度>中密度,土壤总孔隙度排序则与之相反,土壤有效持水量表现为中密度>低密度>高密度;(4)3种密度马尾松人工林综合水源涵养能力为204~237.55 mm,表现为中密度>高密度>低密度.综上,丹江口库区中密度马尾松人工林水源涵养服务能力最优,建议在今后库区森林抚育过程中,合理控制林分密度.     

城市植被调查的取样面积推算与遗漏植物曲线

种—面积关系常用于确定自然植被调查的取样面积,但其在城市植被中的应用依然少见报道。基于重庆市3个行政区共54个样地,采用巢式样方法和随机样方法同时调查样地所有植物,揭示城市植物种—面积关系,分析城市植物调查的取样面积推算方法,并通过遗漏曲线揭示两种调查方法遗漏植物的规律。研究结果表明:巢式样方法下,种—面积曲线符合Logistic函数和Allometrica1函数的变化规律(R^2>0.90),相关公式可用于推算最小取样面积,且取样精度越高则所需最小取样面积增加量越大。公园及居住区绿地,调查到植物种数的比例从60%逐渐增加到90%时,所需最小取样面积的平均值从17.7 m^2逐渐增加到162.0 m^2。在巢式样方法下,取样面积从100 m^2增加到625 m^2,公园和居住区绿地中遗漏的植物(未被调查到的植物),种数比例分别从15.17%和13.98%降低至1.42%和0.42%。目前城市植物调查中常用的100 m^2样方面积下,公园和居住区中遗漏的物种中,分别有78.1%和81.8%为频率3.7%的低频物种。公园和居住区绿地中,遗漏植物的频率—种数关系均符合Hyperb1函数曲线(R^2>0.95)。草本植物调查中常用的随机样方法(3个1m×1m样方),遗漏草本植物的种数平均为公园草本植物的41.44%、居住区草本植物的49.58%,其中A级频率物种分别占公园及居住区的93.48%和93.22%。随机样方法下,公园和居住区绿地遗漏草本植物的频率—种数关系符合Logistic函数曲线(R^2>0.94)。研究结果和方法可为城市植物多样性调查取样方法的确定和评价提供一定的理论参考。