青花菜Ogu不育胞质分子鉴定和序列分析

雄性不育是农作物利用杂种优势、进行轮回选择和群体改良的重要手段,在农作物生产中具有巨大的利用价值。该研究为了鉴定青花菜细胞质雄性不育材料的不育胞质类型,以期今后为青花菜种质资源的收集、利用及分子标记辅助育种提供新的不育标记。根据Gen Bank中orf138基因保守序列设计特异引物,对20个青花菜种质资源基因组DNA进行PCR扩增。结果表明:特异引物P1/P2在12个青花菜雄性不育基因型中均扩增出392 bp的片段,在8个可育基因型中未扩增出条带,与田间育性鉴定结果相符。获得青花菜Ogu胞质雄性不育的特异基因orf138序列,Gen Bank中的登录号为HQ149728;用Blastn在Gen Bank中进行同源性比对分析,发现12个不育材料的特异片段与已报道的萝卜Ogu CMS所具有的Ogu orf138基因(Genbank登录号:Z18896.1)同源度高达100%。序列同源比对发现orf138基因存在变异位点。研究结果可为青花菜雄性不育细胞质的分子鉴定、进一步阐明胞质雄性不育败育机理,以及指导青花菜新型不育系的创建和杂种优势高效利用提供理论依据。     

水稻抗褐飞虱基因SCAR标记的获得

采用282个随机引物对药用野生稻1665和栽培稻桂99远缘杂交的抗褐飞虱近等基因系B3F4分离群体的不抗池DNA和抗池DNA进行了特异性RAPD标记筛选,从中筛选到一个具有明显的特异性扩增带谱的RAPD标记S1159,序列分析表明,S1159序列长度为1408bp,与基因库中已报道的水稻第四号染色体的BAC克隆(编号OSJNBa0070O11)序列(67114-69100)有51.86%的同源性。为了提高所找到的RAPD标记S1159在应用上的稳定性,将RAPD标记转化为SCAR标记检测近等基因系群体,结果表明与RAPD标记结果一致,说明该研究得到的RAPD标记具有较好的稳定性和重复性,为进一步的研究打下了良好的基础。     

细胞质雄性不育辣椒育性恢复基因特异分子标记的筛选

利用集团分离分析法(Bulked segregant analysis BSA),以辣椒细胞质雄性不育系BU-12、恢复系RF-12为材料共筛选了336条RAPD引物,其中引物S418在恢复系中呈现特异性扩增,得到一条约3000bp的特异片段。回扩得到两条片段,测序表明大小为1515bp,1162bp。荧光原位杂交证实1515bp片段为恢复系特有,命名为S4181515。序列分析表明S4181515为一新发现的序列,Blastn序列比对同源性小于40％,tBlastx比对发现该序列与水稻2、4、7、10号染色体的几个BAC克隆上的序列高度同源。推测可能与其具有相似的编码功能,为进一步从分子水平研究辣椒育性恢复打下了坚实的基础。根据测序结果设计特异引物,将S4181515转化成特异PCR标记,证明能用于候选材料的初筛。     

大白菜细胞质雄性不育保持系3411-7——RAPD特异扩增片段的克隆测序

利用RAPD技术从大白菜细胞质雄性不育保持系3411-7的DNA中得到一个特异扩增片段MOPB04600。回收该特异扩增片段并将其克隆到pGEM-TEasy载体上进行序列测定。结果表明该片段全长600bp,其碱基组成为A+T=72.33%。通过与GenBank+EMBL+DDBJ+PDB中的455,972个序列进行同源性比较,同源性均小于30%,表明该片段为一新发现的序列。并对该特异片段的来源及其可能的作用进行探讨。     

细胞质雄性不育辣椒育性恢复基因特异分子标记的筛选

利用集团分离分析法(Bulked segregant analysis BSA),以辣椒细胞质雄性不育系BU-12、恢复系RF-12为材料共筛选了336条RAPD引物,其中引物S418在恢复系中呈现特异性扩增,得到一条约3000bp的特异片段。回扩得到两条片段,测序表明大小为1515bp,1162bp。荧光原位杂交证实1515bp片段为恢复系特有,命名为S418_(1515)。序列分析表明S418_(1515)为一新发现的序列,Blastn序列比对同源性小于40%,tBlastx比对发现该序列与水稻2、4、7、10号染色体的几个BAC克隆上的序列高度同源。推测可能与其具有相似的编码功能,为进一步从分子水平研究辣椒育性恢复打下了坚实的基础。根据测序结果设计特异引物,将S418_(1515)转化成特异PCR标记,证明能用于候选材料的初筛。     

亚麻中雄性不育基因同源序列MS2-F的克隆和表达分析

用同源序列克隆法从亚麻中克隆了雄性不育基因同源序列MS2-F cDNA(登陆号:EU363493).该cDNA全长1 91lbp,包含一个1 608 bp的ORF,编码535个氨基酸.推导的蛋白质序列中包含2个雄性不育保守区:NAD结合区域和雄性不育C-末端区域.该基因与油菜和拟南芥雄性不育基因的一致性分别为59.65%和59.16%,为花蕾特异表达基因,推测在亚麻花粉发育过程中与脂酰辅酶A还原酶有相似功能.MS2-F cDNA对应的gDNA大小为2 696 bp(登陆号:EU365361),含有8个内含子和9个外显子.     

辣椒胞质雄性不育系CaCOX3的克隆与表达分析

探究线粒体呼吸链第4个复合体亚基细胞色素氧化酶第三亚基(COX3)与辣椒胞质雄性不育之间的关系,为研究辣椒CMS与能量代谢的关系提供参考。以辣椒胞质雄性不育系9704A和保持系9704B为材料,根据GenBank报道的辣椒线粒体基因组序列,设计特异引物扩增CaCOX3,进行生物信息学分析,并研究其时空表达特性,比较两系间的差异。在辣椒胞质雄性不育系9704A和保持系9704B中克隆获得的目的基因CaCOX3,全长均为798 bp,编码265个氨基酸残基;辣椒保持系9704B不同组织中,CaCOX3表达存在差异,果皮中表达最高,叶中表达最低。在不同的花蕾发育时期,两系CaCOX3表达存在差异。胞质雄性不育系9704A的造孢细胞增殖期和花粉母细胞减数分裂期,CaCOX3的表达量明显低于保持系9704B;在小孢子单核期,两系CaCOX3的表达量持平;在小孢子成熟期,胞质雄性不育系明显高于保持系。CaCOX3在辣椒胞质雄性不育9704A和保持系9704B的时空表达存在差异,可能引起能量代谢异常,造成不育。     

甘蓝Ogura胞质雄性不育基因的SRAP标记

本研究以甘蓝Oguar胞质雄性不育系CMS451及其保持系为材料,优化甘蓝SRAP体系,并用SRAP标记分析了Oguar胞质不育基因。结果表明:总反应体积为25μL,含有Mg Cl2,2.5 mmol/L;primer,0.2μmol/L;DNA,45ng;NTPs,0.4 mmol/Ld;1.5 U Taq DNA聚合酶,2.5μL10×buffer,其余用dd H2O填充;这个体系适合甘蓝的SRAP标记。利用92对SRAP组合引物和优化的SRAP体系,发现Me6Em8扩增出稳定的特异条带,特其大小在250-500bp之间,对其进行单株验证,用Jionmap ver3.0分析计算出此条带与不育基因的遗传距离为22.548c M。     

胞质雄性不育相关基因的克隆及其表达分析

根据GenBank中orf224和atp6基因的保守序列设计特异引物,对不结球白菜Pol胞质雄性不育系的基因组DNA进行特异扩增,获得了Pol胞质雄性不育的特异基因orf224和atp6的DNA序列.用Blastn在GenBank中进行同源性比对分析,发现不结球白菜orf224c和atp6c基因与已报道的orf224和atp6基因的同源性高达100%,在GenBank中的登录号依次为DQ400846、DQ412559.运用半定量RT-PCR对orf224c基因在不同器官中的表达水平进行分析,结果表明:不育系花期叶片中该基因的表达量比长度小于0.5 mm蕾和雄蕊中的明显低,在后2个器官中的表达量无明显差异;而在保持系的上述3个器官中的表达量无明显差异.该结果显示orf224基因表达上调与孢原细胞分化受阻相关.     

大白菜细胞质雄性不育系RAPD特异扩增片段的克隆及其序列分析

利用RAPD技术从大白菜细胞质雄性不育系CMS3411-7的DNA中得到1个特异扩增片段CMSO-PL01670,进一步以该片段为探针进行Dot和Southern杂交证实了该片段为不育系所特有。回收该特异扩增片段并将其克隆到pGEM-T Easy载体上进行序列测定。测序结果表明该片段全长673bp,其碱基组成为A T=67.16％。通过与GenBank EMBL DDBJ PDB中的455 972个序列进行比较,同源性均小于30％,表明该片段为一新发现序列。并且该序列的 4 - 216的区域内含有1个可编码70个氨基酸的开放阅读框架。上述结果为今后从分子水平进一步研究大白菜细胞质雄性不育打下了坚实的基础。