水稻EPSP合酶第一内含子增强外源基因的表达

分离并克隆了水稻5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因的第一内含子(EPI). 序列分析表明, EPI长704 bp, GC含量为36.2%. 为进一步研究EPI序列在转基因植物中对外源基因表达水平的影响, 将EPI序列插入CaMV35S启动子和报导基因β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase, GUS)基因(gus)之间. 采用基因枪法转化烟草叶片, gus基因瞬时表达表明, EPI序列的存在可以使GUS的表达水平提高. 利用农杆菌法转化烟草, 获得了gus基因稳定表达的植株. GUS活性检测表明EPI内含子的存在可以显著提高GUS基因的表达(P<0.01). Northern blot 分析表明, 在转录水平上gus基因在含EPI内含子的转基因植株中的表达高于不含EPI gus基因的表达, 并且成熟的gus mRNA中EPI被正确剪取掉了, 表明是一种非转译的内含子. GUS定量检测表明, EPI存在可以使GUS的平均表达水平提高3倍, 最高单株可提高6倍.     

桃(Prunus perscia)中一个AGAMOUS同源基因第二内含子序列的克隆和鉴定

本研究首先从桃中克隆了AGAMOUS(AG)同源基因PpMADS4的第二个内含子--pPpMADS4，全长约2.1kb。序列分析表明，该内含子含有一些对基因表达十分重要的调控元件。同时，克隆了七个不同桃品种中的PpMADS4基因的第二内含子，序列比对和SNP测算表明，PpMADS4第二内含子是一段SNP富集区域，具有高度的核苷酸多态性，但是在这段序列上各个调控元件的序列和位置都非常保守，暗示了这些调控元件可能具有很重要的生物学功能。为了认识这一内含子的调控功能，将pPpMADS4与minimal35S连接并与GUS基因融合，构建表达载体转入野生型拟南芥中。GUS染色显示，其表达主要分布在花的两轮生殖器官上，这与拟南芥中AG第二内含子调控的GUS着色部位相似，但存在着差异。PpMADS4第二内含子能够特异启动GUS在花发育晚期的表达。     

水稻红莲型不育系雄性配子发育过程中线粒体功能基因转录本的编辑位点研究

RNA编辑普遍存在于高等植物线粒体中,是线粒体产生功能蛋白所必不可少的过程。以红莲(HL)型水稻细胞质雄性不育系粤泰A、保持系粤泰B及杂种红莲优6四分体时期的花药、单核花粉和二核花粉为材料,研究了线粒体功能基因———atp6、coxⅡ及嵌合基因orfH79转录本的编辑位点。结果表明,atp6转录本的编辑能力明显受到恢复基因的影响。atp6转录本在不育系中不被编辑或部分编辑,而在引入了恢复基因的杂种一代中,其编辑能力均大幅提高。coxⅡ转录本在3个材料中编辑状态没有差别,而嵌合基因orfH79在各个材料中均不被编辑。由此推测,红莲型水稻细胞质雄性不育与atp6转录本编辑能力的基本丧失紧密相关。     

大白菜orf224基因植物表达载体的构建及遗传转化

为了创制新的大白菜雄性不育材料,双酶切重组质粒pMD18-T-CMS7311-orf224和表达载体pWR306后,将CMS7311-orf224基因与线性表达载体pWR306进行定向连接,构建了细胞质雄性不育线粒体基因CMS7311-orf224的植物表达载体pWR-CMS7311-orf224,通过酶切和PCR验证pWR-CMS7311-orf224载体构建正确.采用快速冻融法,将表达载体导入农杆菌EHA105,转化大白菜材料06J28,对转化植株的GUS、PCR和RT-PCR检测表明,获得了2个大白菜转基因植株.     

大豆转录因子GmC2H2基因转化拟南芥效果分析

GmC2H2转录因子基因是本实验室获得的一个编码172个氨基酸携带516bp核苷酸的转录因子,属于经典C2H2型锌指蛋白.通过构建植物表达载体GmC2H2-pCAMBIA1304,借助优化的Floral-dip法转化模式植物拟南芥,经潮霉素Hygromycine( 45-50 mg/L)抗性筛选获得转基因拟南芥植株.GUS组织染色分析表明,GmC2H2基因在生长12d的转基因拟南芥幼苗中,表达部位主要集中在根部.对转基因拟南芥进行了低温(1℃)和脱落酸(200 μmol/L)胁迫处理,测定其生理生化指标,通过real-time qPCR确定目的基因在转基因拟南芥中的表达情况.结果表明,携带GmC2H2目的基因的转基因拟南芥中脯氨酸和可溶性糖水平要高于野生型植株,而丙二醛水平要低于野生型,在抗逆性方面明显优于野生型拟南芥植株;并且胁迫处理下的转基因拟南芥中GmC2H2基因的表达量要高于未胁迫处理的转基因植株,说明GmC2H2基因的表达受低温和ABA的诱导,初步明确了该转录因子基因的功能.     

内含子数量改变GUS基因的瞬时表达调控

内含子是基因的重要组成部分,它与功能基因表达之间的关系越来越被重视.本研究以pCAMBIA3301为载体,利用玉米泛素启动子Ubi1和水稻肌动蛋白启动子Actin1构建两个GUS基因表达载体p33U1和p33A1,同时设置3个对照载体.通过基因枪轰击法将上述载体转入水稻胚性愈伤组织,探讨内含子对外源目的基因表达的调控作用.组织化学检测结果表明:CaMV35S启动子调控下的iGUS (带内含子)基因能够顺利表达;同样,Actin1启动子(带内含子)调控下的不带内含子的GUS基因也可以正常表达,而当Actin1启动子(带内含子)驱动iGUS基因时,则导致GUS染色反应不能发生.Ubi1启动子(带内含子)调控GUS基因的瞬时表达也得出类似结果,证明表达框中内含子的数量为1个或两个时,对GUS基因的表达起到了不同的调控作用.本研究结果对植物表达载体构建及功能基因表达都具有指导意义.     

RTS启动子与GUS的嵌合基因在转基因水稻花药中的专一性表达

通过PCR扩增 ,从籼稻品种IR36中克隆了RTS启动子的DNA片段 ;序列分析表明 ,所克隆的DNA片段含 12 5 7个核苷酸 ,与Lee等 (1996 )报告的序列比较 ,核苷酸同源性为 97.1% ;将 - 12 2 8～ 2 5的RTS启动子区段与GUS编码区组成的嵌合基因插入双元载体的T DNA中 ,经根癌农杆菌介导转化 ,得到转基因水稻植株。GUS活力检测表明 ,此嵌合基因不仅能在花药绒毡层 ,而且还在花药表皮细胞、药室内壁以及花粉中表达 ,而 - 783～ 2 5的 5’上游区与GUS编码区组成的嵌合基因则未在转基因水稻的花药中检测到其表达。     

在转基因水稻植株中蜡质基因第1内含子对-基因表达影响的分析

为阐明水稻Wx基因第1内含子在整体植株的胚乳发育阶段是否确有增强基因表达的功能,以及弄清高和中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子1 126个碱基之间有差异的16个碱基中哪几个碱基影响了该内含子的正常剪接从而降低了基因的表达水平,我们分别用高直链淀粉含量品种的Wx基因翻译起始密码子ATG上游3.1和2.1 kb片段与GUS基因编码区融合构建成嵌合质粒,并在此基础上,(1)去除嵌合质粒中Wx基因的第1内含子;(2)将嵌合质粒Wx基因的第1内含子中(3.1 kb)与中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子有差异的6个碱基以中、低直链淀粉含量的水稻品种的碱基替换.将上述改造过的几种质粒分别转化粳稻品种中花11,测定转化植株未成熟种子胚乳中的GUS活性.结果表明第1内含子的缺失或此内含子的5′端剪接点上的碱基G以T替换均造成GUS活性的急剧下降,说明第l内含子在植株体内的确有增强基因表达的功能,而且在中、低直链淀粉含量的水稻品种中Wx基因第1内含子5′端剪接点上自然存在的G→T突变是造成这些品种中该内含子剪接不正常、从而使Wx基因表达水平和直链淀粉含量下降的主要原因.     

盐胁迫下大豆转录因子GmTFIIIC功能研究

大豆是中度耐盐植物,土壤盐碱化会对大豆产量及品质造成严重影响。因此挖掘耐盐基因,提高大豆耐盐能力十分必要。真核生物中,转录因子TFIIIC作为RNA聚合酶III转录机制的辅助因子,其转录活性易受到外部因素的影响,进而影响tRNA基因转录效率和蛋白质的合成。本课题组前期研究发现大豆GmTFIIIC在盐胁迫下上调表达,但目前大豆GmTFIIIC的抗逆功能还不清楚。本研究通过大豆发状根体系,将GmTFIIIC基因过表达,进行盐胁迫下转基因复合体植株表型及生理指标分析,研究大豆GmTFIIIC基因在盐胁迫下的功能。结果表明:GmTFIIIC基因过表达,盐胁迫条件下,大豆转基因复合体根、茎的Na+/K+要低于野生型空载对照;叶片叶绿素相对含量高于野生型空载对照;叶片H2O2和O-2含量低于野生型空载对照;叶片含水率高于空载对照,表明大豆发状根中过表达GmTFIIIC基因提高了大豆转基因复合体的耐盐能力。研究结果为大豆GmTFIIIC基因耐盐功能研究提供理论基础。     

水稻OsBP-73基因表达需要其内含子参与

该实验室以前的研究表明,水稻OsBP-73基因含有2个外显子和1个长度为2 471 bp的内含子.该文报告用OsBP-73基因ATG翻译起始密码子(在第1外显子中)上游序列(1- 818～ 215)与GUS基因构成嵌合质粒pRSSl,将该质粒转化水稻后,在抗性愈伤组织和转基因植株中未能检测到GUS基因的表达.只有用含有完整的内含子及其上游序列(1 818～ 2 844)与GUS基因构成嵌合质粒(p13GNF)时,才能在p13GNF的转基因抗性愈伤组织和植株中检测到GUS基因的表达.实验还证明,单是内含子序列并不能驱动GUS基因在转基因水稻中表达.由此推测:OsBP-73基因的启动子序列驱动基因表达时,需要基因内含子的参与.