杜氏盐藻RuBisCO小亚基基因的克隆和分析

根据莱菌衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、团藻(Volvox carteri)、伞藻(Acetabularia cliftonii)等生物的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCO)的小亚基rbcS基因氨基酸的高度保守序列,设计一对简并引物,进行RT-PCR.209 bp的PCR产物经测序分析及进行氨基酸序列同源性比对,表明克隆的序列为盐藻rbcS基因的cDNA片段.根据该序列信息,采用RACE(rapid amplification of cDNA ends) 方法扩增其5'上游未知区和3'下游未知区.5'RACE得到的cDNA长度为约300 bp,3'RACE得到的长度约380 bp.三段序列拼接后cDNA全长为878bp,其中开放读码框包括190个氨基酸.此cDNA序列,推导成氨基酸序列与已知物种的rbcS基因相比对,同源性分别为V.carteri 78%,C.reinhardtii 75%,A.cliftonii 67%,据此可推断所克隆的序列为盐藻RuBisCO的小亚基cDNA序列,GenBank收录号为AY739272.     

龙葵叶绿体ATP合酶α-亚单位基因的克隆

本研究以菠菜叶绿体DNA 2.45kb的SalI片段(含有ATP合酶α-亚单位基因)为探针,从龙英叶绿体DNA BamHI片段文库中筛选出含龙葵叶绿体atpA基因的克隆。通过Southrcn吸印与探针杂交,证明了重组质粒pSB 132的插入片段含有atpA基因。同时将atpA基因定位在龙葵叶绿体DNA SalI、BglI、XhoI和BamHI 4种酶切图谱的限制性片段上。     

杜氏盐藻psaB基因cDNA的克隆与序列分析

根据真核生物莱茵衣藻(Chlamydornonas reinhardtii)、Chlamydomonas moewusii、Chlorella vulgaris以及Mesostigma viride的psaB基因的氨基酸高度保守序列,设计一对简并引物,利用TRIzol试剂提取杜氏盐藻(Dunaliella salina)细胞的总RNA,通过RTPCR,得到的一段长为1．8kb左右的cDNA片段。PCR产物经T-A克隆并测序分析以及测序结果推导成氨基酸序列进行同源性比较．表明所克隆的1815bp序列为杜氏盐藻psaB cDNA片段,GenBank收录号为AY820754。根据已经得到的psaB序列推导成氨基酸序列与一些已知物种的psaB基因相比较,同源性分别为Chlamydomonas reinhardtii 92％,Chlamydornonas moewusii 91％,Chlorella vulgaris 86％,Mesostigma viride 85％,Physcomitrella patens subsp．Patens 85％,Nephroselmis olivacea 84％。据此可推断本实验中所克隆的序列为杜氏盐藻psaB cDNA序列.     

杜氏盐藻泛素基因cDNA的克隆及系统进化分析

根据玉米,水稻等物种泛素序列设计一对简并引物.提取杜氏盐藻细胞的总RNA,利用RT-PCR方法扩增盐藻泛素基因的cDNA片断,回收两个长度不同的片断ubi-1和ubi-2,将其克隆到pMDl8-T载体上,测序后进行序列分析,为克隆杜氏盐藻泛素基因的cDNA序列并进行进化分析.结果 ubi-1经测序后得到一个完整拷贝(228 bp)和一个不完整的泛素cDNA序列(191 bp).Ubi-2经测序后得到两个拷贝(556 bp)和一个不完整的泛素cDNA序列(191 bp).盐藻3个不同拷贝泛素cDNA序列之间存在差异,但所编码氨基酸序列相同.盐藻泛素cDNA序列与其他物种的泛素cDNA序列具有高的同源(70%～85%),所推导的氨基酸序列与其他物种仅存在1～2个氨基酸的差异.进化分析显示,所分离的盐藻泛素基因与两个模式生物果蝇和衣藻的泛素基因共处一个进化支,彼此亲缘关系最近.盐藻泛素基因与其他物种的泛素基因可能来自共同的"祖先"基因.在进化中高度保守.     

杜氏盐藻psaB基因cDNA克隆及系统进化分析

根据真核生物莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、Chlamydomonas moewusii及Chlorella vulgaris等光系统Ⅰ反应中心蛋白psaB基因的氨基酸高度保守序列,设计一对简并引物,利用TRIzol试剂提取杜氏盐藻(Dunaliella salina)细胞的总RNA,通过RT-PCR,得到的一段长为1.8kb左右的cDNA片段。PCR产物经T-A克隆并测序以及测序结果推导成氨基酸序列进行同源性比较,表明所克隆的1815bp序列为杜氏盐藻光系统Ⅰ反应中心psaB基因的cDNA片段,GenBank收录号为AY820754。根据已经得到的psaB的核苷酸序列推导成氨基酸序列与一些已知物种的psaB氨基酸序列相比较,同源性分别为Chlamydomonas reinhardtii 92%,Chlamydomonas moewusii 91%,Chlorella vulgaris 86%,Mesostigma viride 85%,Phy -scomitrella patenssubsp.Patens 85%,Nephroselmis olivacea 84%。此外,psaB密码子偏爱性分析表明:杜氏盐藻psaB基因第三位密码子A和T的组成分别为35.7%和39.17%,而G和C分别为7.27%和17.85%,即杜氏盐藻psaB基因密码子的组成大多为NNA和NNT。根据psaB基因的特征,作者对绿藻门的50个物种的psaB基因作了进化分析,结果表明:杜氏盐藻与Haematococcaceae中的大多数种类进化地位最为接近,这为更进一步弄清杜氏盐藻的遗传背景提供了理论依据。     

丙肝病毒融合抗原基因NS3-C定点整合入衣藻 叶绿体基因组的研究

用PCR方法从丙型肝炎病毒(HCV) cDNA文库中克隆了两段DNA片段,即HC基因组非结构NS3区抗原基因(约0.7 kb)和核心抗原C区抗原基因(约0.6 kb)的cDNA片段。在两段cDNA间加入连接肽Ser-Pro-Gly-Ser的密码子序列,构建成融合抗原基因NS3-C。将该融合基因与衣藻叶绿体基因atpA的启动子和rbcL基因的3'末端连接,得到丙肝病毒融合抗原基因NS3-C表达盒,再将该表达盒与选择标记基因aadA表达盒和衣藻叶绿体基因组同源片段连接,构建成衣藻叶绿体转化载体pSS6。基因枪法转化衣藻叶绿体,经壮观霉素筛选获得转化再生的单藻落,对转基因衣藻的PCR和Southern杂交分析表明,融合抗原基因NS3-C已整合到衣藻叶绿体基因组中。 Abstract:　Two DNA fragments encoding the nucleocapsid (C) region protein and the non-structural region 3 (NS3) protein of hepatitis C virus(HCV) were amplified from cDNA library by using PCR method. The 5' terminal of C cDNA fragment was linked up with the 3' terminal of NS3 cDNA fragment by a oligonucleotide linker Ser-Pro-Gly-Ser to form a chimeric gene NS3-C, which was placed under the control of the chloroplast atpA promoter and rbcL 3' region of Chlamydomonas reinhardtii to construct the chimeric gene NS3-C cassette. Then the NS3-C cassette was linked with selectable gene aadA cassette and the chloroplast homologous fragments of Chlamydomonas reinhardtii to generate transformation vector pSS6. Chloroplasts of Chlamydomonas reinhardtii were transformed by particle bombardment. Plastid transformants were selected by their resistance to 100 mg/L of spectinomycin. PCR and Southern hybridization analysis showed that the chimeric gene NS3-C had been integrated into chloroplast genome of Chlamydomonas reinhardtii.     

甜菜ATP合酶β亚基基因atpB的克隆、序列分析及进化

atpB基因编码ATP合酶β亚基,是光合作用中的重要基因。ATP合酶是生物体内能量代谢的关键酶,参与氧化磷酸化和光合磷酸化反应。利用植物叶绿体基因组在进化过程中高度保守的特点,根据已知植物烟草、水稻和菠菜等的叶绿体基因组全序列,设计并合成了一对引物,以甜菜叶绿体DNA为模板,PCR扩增得到包含atpB完整基因(GenBank登录号为DQ067451)在内的一段序列,测序与序列分析表明:该克隆片段全长2 293 bp,其中包括有1 497 bp的编码区序列,推测编码498个氨基酸。同源性比较,该克隆基因与烟草、菠菜、油菜、水稻atpB基因的核苷酸序列同源性分别为90.92%、95.79%、87.71%和86.37%,推测的氨基酸序列同源性分别为94.58%、97.19%、92.17%和91.97%。同时,建立了几种植物的氨基酸序列系统进化树。     

丙肝病毒融合抗原基因NS3-C定点整合入衣藻叶绿体基因组的研究

用ＰＣＲ 方法从丙型肝炎病毒（ＨＣＶ） ｃＤＮＡ 文库中克隆了两段ＤＮＡ 片段,即ＨＣＶ 基因组非结构ＮＳ３区抗原基因（约０．７ ｋｂ）和核心抗原Ｃ区抗原基因（约０．６ ｋｂ）的ｃＤＮＡ 片段。在两段ｃＤＮＡ 间加入连接肽Ｓｅｒ－ Ｐｒｏ－ Ｇｌｙ－ Ｓｅｒ 的密码子序列,构建成融合抗原基因ＮＳ３－ Ｃ。将该融合基因与衣藻叶绿体基因ａｔｐＡ 的启动子和ｒｂｃＬ 基因的３′末端连接,得到丙肝病毒融合抗原基因ＮＳ３－ Ｃ表达盒,再将该表达盒与选择标记基因ａａｄＡ 表达盒和衣藻叶绿体基因组同源片段连接,构建成衣藻叶绿体转化载体ｐＳＳ６。基因枪法转化衣藻叶绿体,经壮观霉素筛选获得转化再生的单藻落,对转基因衣藻的ＰＣＲ 和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交分析表明,融合抗原基因ＮＳ３－ Ｃ已整合到衣藻叶绿体基因组中。     

甜菜ATP合酶β亚基基因atpB的克隆、序列分析及进化

atpB基因编码ATP合酶β亚基,是光合作用中的重要基因。ATP合酶是生物体内能量代谢的关键酶,参与氧化磷酸化和光合磷酸化反应。利用植物叶绿体基因组在进化过程中高度保守的特点,根据已知植物烟草、水稻和菠菜等的叶绿体基因组全序列,设计并合成了一对引物,以甜菜叶绿体DNA为模板,PCR扩增得到包含atpB 完整基因（GenBank登录号为 DQ067451）在内的一段序列,测序与序列分析表明：该克隆片段全长2 293 bp,其中包括有1 497 bp的编码区序列,推测编码498个氨基酸。同源性比较,该克隆基因与烟草、菠菜、油菜、水稻atpB基因的核苷酸序列同源性分别为90.92%、95.79%、87.71%和86.37%,推测的氨基酸序列同源性分别为94.58%、97.19%、92.17%和91.97%。同时,建立了几种植物的氨基酸序列系统进化树。     

用简并寡核苷酸探针筛选对虾白斑综合征病毒DNA多聚酶基因片段

根据一些病毒的DNA多聚酶氨基酸序列中特有的保守序列VYGDTD设计的简并寡核苷酸 ,经地高辛标记后与对虾白斑综合征病毒基因库克隆杂交 ,筛选出一段长度为 70 7bp的EcoRI基因片段 ,该片段在一个开放阅读框内。并含DNA多聚酶B家族特有的保守序列YGDTDS。经与基因库比较 ,其氨基酸序列与藻类DNA病毒科 (Phycodnaviridae)的几株藻类病毒的DNA多聚酶片段有部分相似 ,因此推测该核苷酸片段为对虾白斑综合征病毒DNA多聚酶基因的部分序列。     

作物数量遗传学基础 二、遗传力及其估算

两栖类染色体的研究,过去多使用以生殖 细胞和端蚌尾部上皮细胞为材料的水低渗压片 法^[6]。然而,生殖细胞和峪蚌组织受季节的限 制颇大,所得的中期分裂相亦不甚多。随着 低等脊稚动物组织培养技术^[1,2]与血液培养技 术^[3]的发展,近年来已更多的使用离体培养的 细胞来进行研究。     

The δ subunit of the chloroplast ATPase is plastid-encoded in the diatom Odontella sinensis

A 5.2 kb PstI restriction fragment containing the atpA gene cluster of the plastic genome of the centric diatom Odontella sinensis was cloned. Sequencing revealed a reading frame of 561 bp separating the genes atpF and atpA, which is preceded by a putative ribosome binding site. The third nucleotide of the codon for the last amino acid of atpF is the first nucleotide of the initiation codon of the 561 bp reading frame. The amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of this gene (ntpD) is colinear with δ subunits of different F₀F₁-ATPases and shows an overall sequence homology of up to 35% when compared with the sequences of cyanobacteria and Cyanophora paradoxa. The results are discussed in context with the evolution of chloroplasts of the chlorophyll-a + b and -a + c lineages, respectively.     

A putative gene of tobacco chloroplast coding for ribosomal protein similar to E. coli ribosomal protein S19.

A partial sequence of a cloned 3.2 Md BamHI fragment from tobacco chloroplast DNA revealed the occurrence of a putative gene for ribosomal protein. The putative gene is located on the left margin of the large single-copy region in the chloroplast DNA. The coding region contains 276 bp (92 codons). The amino acid sequence deduced from the DNA sequence shows 55% homology with that of E. coli S19 (91 amino acid residues).     

人canstatin基因转化新型生物反应器－杜氏盐藻(Dunaliella salina)的初步研究

本文采用RT-PCR技术从人的胎盘组织中克隆canstatin基因，定向连接到表达载体pUΩ上，然后与筛选标记bar盒连接得到真核表达载体pUΩ-Can-Bar。采用玻璃珠转化法将该表达载体转化杜氏盐藻（以下简称盐藻），通过草丁膦固体平板筛选得到转化株，进而对转化株进行阳性鉴定。PCR结果显示，在盐藻转化株中均能够扩增出约700 bp特异的条带，而在阴性对照中没有扩增出该条带。Southern blot结果进一步证明人canstatin基因已经整合到盐藻细胞的基因组中。此外，本文对盐藻转化株的遗传稳定行进行了分析，结果表明canstatin基因能够在转化藻株中稳定遗传。人canstatin转基因盐藻株的成功制备为利用盐藻反应器大规模生产人canstatin蛋白提供了实验依据，为及早实现canstatin蛋白在治疗肿瘤上的临床应用提供了前期工作基础。     

细胞质雄性不育高粱叶绿体 ndh D 基因的序列变异

片段SAAU－02 700特异地扩增自7种具可育细胞质的高粱材料的总DNA,含有叶绿体psa C(88bp)和ndh D(192bp)基因的部分序列。该片段与Eco Ri HindⅢ酶切的总DNA,线粒体DNA和叶绿体DNA杂交,在总DNA中获得了0.74kb的杂交带,而在叶绿体中获得0.74kb和0．45kb两条杂交带。与线粒体DNA无杂交;与经Hae Ⅲ酶切的总DNA杂交,在不育系中获得4．9kb的杂交带,而保持系的杂交带为4．45kb。参考GenBank中高粱的近缘物种玉米叶绿体基因组的序列,构建了ndh D基因区的酶切位点图谱,借此分析得出高粱不育系的叶绿体ndh D基因序列已发生改变。这种变异与高粱细胞质雄性不育反生的关系正在探讨中。     

杜氏盐藻rbcS启动子的克隆和功能分析

为提高转基因盐藻的表达效率，利用基因组步行方法和巢式PCR，从盐藻中克隆了1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）的小亚基基因rbcS 的5'上游调控序列，并对其进行序列分析和转基因功能分析。采用Dra I、EcoR V、Pvu II和Stu I四种平端限制内切酶分别酶切盐藻基因组DNA，并与接头连接，构建基因组步行文库GWL 1、GWL 2、GWL 3和GWL 4；设计特异引物从这四种文库中扩增rbcS基因的5'上游调控序列。在GWL 1、GWL 4中分别扩增出约1.2 kb的片段。对该序列的分析表明，它的3'端与已知盐藻rbcS cDNA 的5'端序列完全一致，说明是该基因的5'端上游区，并且包含多个与转录调控有关的保守序列（如TATA-box、CAAT-box），富含GT的重复序列。此序列EcoR I下游的片段与除草剂抗性基因bar相融合，构建表达载体，电击法转化盐藻。通过对转化藻株的抗性筛选以及PCR和Southern blot检测，表明该区域能驱动外源基因bar在转基因盐藻中的表达，推断是盐藻rbcS基因的启动子调控区。     

Identification of a gene encoding the light-harvesting chlorophyll a/b proteins of photosystem I in green alga Dunaliella salina.

There are four LhcII genes of Dunaliella salina have been submitted to the database of GenBank. However, little is known about Lhca genes of this green alga, although this knowledge might be available to study the composition and phylogenesis of Lhc gene family. Recently, one Lhca gene was been cloned from the green alga D. salina by PCR amplification using degenerate primers. This cDNA, designated as DsLhca1, contains an open reading frame encoded a protein of 222 amino acids with a calculated molecular mass of 27.8 kDa. DsLhca1 is predicted to contain three transmembrane domains and a N-terminal chloroplast transit peptide (cTP) with length of 33 amino acids. The genomic sequence of DsLhca1 is composed of five introns. The deduced polypeptide sequence of this gene showed a lower degree of identity (less than 30%) with LHCII proteins from D. salina. But its homology to Lhca proteins of other algae (Volvox carteri Lhca_AF110786) was higher with pairwise identities of up to 67.1%. Phylogenetic analysis indicated that DsLhcal protein cannot be assigned to any types of Lhca proteins in higher plants or in Chlamydomonas reinhardtii.     

Isolation and characterization of the catalase gene from Rhizobium sp. SNU003, a root nodule symbiont of Canavalia lineata

A catalase gene from Rhizobium sp. SNU003, a root nodule symbiont of Canavalia lineata, was cloned and its nucleotide sequence was determined. The Rhizobium DNA of about 280 bp was amplified using two PCR primers synthesized from the conserved sequences of the type I catalase gene. The nucleotide sequence of the amplified fragment revealed three regions that were conserved in the catalase, showing it as being part of the catalase gene. A genomic Southern hybridization using this fragment as a probe showed that the 5.5 kb PstI, 1.8 kb EcoRI, and 0.7 kb StyI fragments hybridized strongly with the probe. The Rhizobium genomic library constructed into the EMBL3 vector was screened, and one catalase clone was selected. The nucleotide sequence of the 5.5 kb PstI fragment from the clone revealed an open reading frame of 1455 bp, encoding a polypeptide of 485 amino acids with a molecular mass of 54,958 Da and a pI of 6.54. The predicted amino acid sequence of the catalase is 66.3% identical to that of Bacteroides fragilis, but was only 53.3% identical to the Rhizobium meliloti catalase.