牛不同供体核克隆囊胚Xist基因DNA甲基化程度的比较研究

利用亚硫酸氢盐测序法分析Holstein奶牛胎儿成纤维细胞(FFB)和输卵管上皮细胞(FOV)来源的克隆囊胚Xist基因DNA甲基化状况,以体外受精囊胚(IVF)和供体细胞作对照.克隆囊胚Xist基因处于较低程度的DNA甲基化状态,其中,FFB来源的克隆囊胚Xist基因DNA甲基化程度为43%,而FOV来源的克隆囊胚仅为17%.在体外受精囊胚中,Xist基因DNA甲基化处于中等状态,为49%.然而,在体细胞中,Xist基因的甲基化程度较高,FFB为66%,FOV为63%.这些结果说明,Xist基因DNA甲基化是可以被重编程的,所检测的CpG岛可能调节Xist基因的表达.结合已发表的实验数据,在同一个体中,FFB来源的克隆囊胚发育率比FOV的低,但其克隆牛胎儿的妊娠率和产犊率比FOV的高,这暗示不同供体核克隆囊胚的重编程是有差异的,并可能影响到胚胎及个体的发育.     

绵羊胎儿成纤维细胞不同处理对核移植重构胚发育的影响

研究供体细胞代数、大小、周期以及基因转染处理对重构胚发育的影响. 结果如下: (i)体外培养5~7代细胞做供体核, 重构胚的桑椹/囊胚率显著高于16~18代细胞的桑椹/囊胚率(17.3% vs. 4.9%, P < 0.05); (ii) 15~25 μm细胞做供体核, 重构胚的桑椹/囊胚率为20.0%, 高于8~15 mm细胞、25~33 μm细胞桑椹/囊胚率(8.0%, 9.7%), 但效果不显著(P > 0.05); (iii) 血清饥饿与非血清饥饿的细胞做供体核, 重构胚的桑椹/囊胚发育率没有显著性差异(11.8% vs. 18.6%, P > 0.05), 但非血清饥饿的效果要好于血清饥饿; (iv) 用0.05 μmol/L秋水仙素处理供体细胞效果最好, 重构胚的桑椹/囊胚率可达27.5%, 而未处理或用0.1 μmol/L秋水仙素处理供体细胞, 重构胚的桑椹/囊胚率分别为17.1%和12.1%, 但三者之间差异不显著(P > 0.05); (v) 以转染绿色荧光蛋白基因(GFP)细胞做供体核, 重构胚的桑椹/囊胚率显著低于非转基因细胞做供体核的桑椹/囊胚率(3.1% vs. 20.4%, P < 0.05). 上述结果表明, 传代少、中等大小的细胞更适合做供体核; 血清饥饿没有必要; 用0.05 μmol/L秋水仙素处理供体细胞有利于重构胚的发育; 转基因供体细胞对重构胚发育有影响.     

卵丘细胞核移植技术生产克隆牛犊

分别以短期培养的5头牛卵丘细胞(1~5 BCC)为细胞核供体, 共用1188枚体外成熟的去核卵母细胞构建了931枚重构胚(78.4%).体外培养后,763枚(82%)发育至2-细胞期,627枚(67.3%)发育至8-细胞期,最后获得囊胚275枚(29.5%).囊胚的平均细胞数为124±24.5 (n = 20).分析不同个体来源的卵丘细胞,同一个体卵丘细胞饥饿与否以及饥饿时间的长短、融合后核/质相容时间(融合到激活的时间长短)等因素对核移植效率的影响发现,5个个体的体细胞核移植囊胚率(14.1%,45.2%,27.3%,34.3% vs 1.5%)有显著差异(P<0.05).同一供体细胞饥饿与否(47.1% vs 44.4%)、饥饿11~12 d (52.5%)和18~19 d (41.6%)均不影响核移植囊胚率(P≥0.05).核/质相容2~3 h的囊胚率(20.3%)显著低于3~6 h组(31.0%,P<0.05). 3~6 h范围内,囊胚率无差异(P≥0.05).其中63枚冷冻的核移植囊胚解冻后移植给31头受体牛,妊娠4例,最后顺利获得2头克隆牛犊.结果表明,牛卵丘细胞饥饿不是核移植成功的关键因素,核质相容程度和供体细胞的个体差异对核移植效率有一定影响.卵丘细胞能够获得全程发育的克隆牛犊.     

以不同类型的转基因细胞为核供体生产牛的转基因克隆胚胎

利用所构建的含新霉素抗性(Neo^r)基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因的双标记选择载体, 通过电穿孔的方法, 分别转染了牛胎儿成纤维细胞、胎儿输卵管上皮细胞、胎儿卵巢上皮细胞、颗粒细胞, 经过800 μg/mL的G418筛选14 d后, 均获得了阳性细胞株. 分别以未转基因牛颗粒细胞和4种细胞系的转基因细胞为核供体, 进行了牛的体细胞核移植. 结果表明: (ⅰ) 转基因与未转基因牛颗粒细胞的重组胚的囊胚发育率(44.6% vs 42.8%)、移植妊娠率(19% vs 25%)差异不显著(P＞0.05); (ⅱ) 比较4种类型转基因细胞的重组胚的囊胚发育率, 发现胎儿输卵管上皮细胞(49.1%)和颗粒细胞(44.6%)最高, 牛胎儿成纤维细胞(37.2%)次之, 胎儿卵巢上皮细胞的重组胚囊胚发育率(22.5%)最低, 三者之间差异显著(P＜0.05). 以上结果显示, 供体细胞的转基因与否对牛克隆胚胎的体外和体内早期发育影响不明显; 通过体细胞核移植技术, 牛胎儿输卵管上皮细胞和颗粒细胞可以有效地生产牛转基因囊胚, 并且绿色荧光蛋白作为一种无毒性作用的筛选标记, 可用于转基因胚胎的筛选.     

奶牛体细胞核移植胚胎产业化生产条件优化北大核心CSCD

通过优化高产奶牛体细胞克隆胚胎体外生产技术条件,制备高质量的奶牛克隆胚胎,旨在提高奶牛体细胞核移植产业化应用效率。就受体卵母细胞去核方法、不同年龄供体牛细胞来源、血清饥饿与否以及不同气相组成培养等条件对奶牛体细胞克隆胚胎生产效率的影响进行了研究和探讨。结果表明,虽然荧光染色辅助去核和盲吸法的去核率、囊胚发育率分别为100%、24.83%和92.44%、28.26%,两者之间无显著差异(P>0.05),但盲吸法操作简单、效率高;不同年龄来源供体牛的细胞系构建的克隆胚胎的囊胚发育率分别为31.43%、25.68%,两者之间没有显著差异(P>0.05);经血清饥饿和未饥饿供体细胞重构的克隆胚胎囊胚发育率分别为24%、29.9%,两者之间没有显著差(P>0.05);富氧和低氧气相培养的克隆胚胎的囊胚发育率分别为28.26%、31.55%,两者之间差异不显著(P>0.05),低氧气相组成更有利于囊胚的发育。根据上述结果,奶牛体细胞核移植胚胎(克隆胚胎)的产业化生产条件为:供体细胞无需进行同期饥饿处理,直接注入到盲吸去核后的受体卵子透明带下构建克隆胚胎,融合后的克隆胚胎在密封的混合三气(5%CO2-5%O2-90%N2)的气相组成下进行体外培养,能保持稳定的囊胚发育率。     

体细胞来源及培养代数对核移植重构胚发育的影响

为探讨体细胞来源及培养代数对核移植重构胚发育的影响,实验采用电融合法将小鼠2—细胞胚胎卵裂球、胚胎干细胞(ES)、胎儿成纤维细胞、耳成纤维细胞、尾尖成纤维细胞、睾丸支持细胞和精原细胞以及不同培养代次的胎儿成纤维细胞进行了核移植。结果显示：2—细胞胚胎卵裂球供核重构胚发育最好,囊胚率为7．4％;ES细胞重构胚虽然发育率低,但仍有囊胚出现,比例为0．7％;胎儿成纤维细胞重构胚最高发育阶段为桑椹胚,比例为0．2％;精原细胞重构胚只能发育到8-细胞阶段,比例为0．3％;其他几类细胞重构胚则仅能发育至4-细胞阶段。不同培养代数的胎儿成纤维细胞重构胚除第3代外都可发育到8-细胞阶段,且发育率差异不显著,但第一代细胞重构胚2-细胞发育率(40．7％)显著低于2、3和4代细胞重构胚。结果表明：不同分化程度的细胞核移植后,重新编程的难易程度是不一样的,分化程度越高则重新编程越难;未调整细胞周期的ES细胞由于多数处于S期,所以重构胚发育率很低;体外培养传代有利于体细胞核移植后重新编程。     

宜昌橙与伏令夏橙种间体细胞杂种

宜昌橙(Citrus ichangensis SwingIe)试管实生苗叶肉原生质体与伏令夏甜橙(C．Sin-ensis Osbeck)胚性悬浮细胞系原生质体,经聚乙二醇(PEG)诱导融合。再生出的胚状体为畸形,转移到生芽培养基中诱导产生丛芽。丛芽微嫁接在15天龄的枳壳砧上成为完整植株。幼叶染色体检查表明,两亲本均为二倍体2n=2x=18,融合后再生出的植株为四倍体2n=4x=36。过氧化物酶(POX)及谷草酰胺转氨酶(GOT)同工酶分析证明,这些四倍体均为体细胞杂种,它们同时含有双亲的酶带。杂种植株叶片形态更像甜橙。植株移八土壤后生长旺盛。     

利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎

以转染了质粒pEGFP-N1的猪胎儿成纤维细胞与体外成熟(in vitro maturation, IVM)的猪卵母细胞构建克隆胚, 比较了细胞转染后G418筛选与否, 卵母细胞IVM持续时间及IVM时氧分压高低对克隆胚早期发育的影响. 结果如下: (ⅰ) G418连续筛选10天所得转GFP细胞的克隆胚卵裂率显著低于非筛选组(47.5% vs. 71.6%, P<0.05), 而囊胚率差异不显著(10% vs. 10.4%, P>0.05); (ⅱ) 相比于36 h IVM, 延长IVM时间至 42 h卵母细胞的核成熟明显改善(83.6% vs. 96.7%, P<0.05); 另外, 虽然IVM 42 h也使得克隆胚卵裂率(59.3% vs. 73.6%)及囊胚率(9. 3% vs. 13.2%)都略有提高, 但效果不显著 (P>0.05); (ⅲ) 7%氧IVM 42 h 的卵母细胞与20%氧处理组相比, 克隆胚的卵裂率(70.6% vs. 67.1%)以及囊胚率(11.8% vs. 12.3%)差异都不明显(P>0.05). 上述结果显示: (ⅰ) G418筛选对转绿色荧光蛋白基因(GFP)克隆胚卵裂不利; (ⅱ) IVM 36和42 h的卵母细胞对克隆胚早期发育影响不明显, 但IVM 42 h有利于核成熟, 因此构建克隆胚时仍以IVM 42 h的卵母细胞为宜; (ⅲ) 低氧对猪转GFP克隆胚早期发育无明显促进作用.     

由成年转基因山羊体细胞而来的克隆山羊

在已经获得的乳腺特异性表达人促红细胞生成素 (rhEPO)成年转基因山羊 (Caprahircus)的基础上 ,取其耳尖成纤维细胞和卵巢颗粒细胞 ,进行体外传代培养 ,然后将这种培养的转基因山羊的体细胞移入去核的处于第Ⅱ次减数分裂中期的卵母细胞中 ,并进行电融合 ,构建重构胚胎 ,重构胚胎在体内培养 6d ,再将发育至囊胚或桑椹胚的重构胚胎移入同步情期的寄母羊子宫内。结果 ,有 2只寄母羊妊娠并最终产下 2只成活的克隆山羊。她们分别来自同一成年母羊的耳尖成纤维细胞和卵巢颗粒细胞。克隆羊经PCR RFLP图谱分析显示 :以克隆羊组织DNA为模板的PCR产物与相应的提供体细胞的基因羊的PCR产物的酶切图谱完全一致 ;并且经PCR对外源hEPO基因检测表明 2只克隆山羊均携带hEPO外源基因。由此证明获得了转基因成年体细胞的克隆山羊     

渗透剂对白刺花体细胞胚成熟及萌发的影响

该研究以蔗糖、麦芽糖、山梨醇及PEG(6000)为渗透剂,探讨了不同渗透剂对白刺花体细胞胚发育、胚成熟及萌发的影响。结果表明:白刺花下胚轴形成的胚性愈伤组织接种至MS+2,4-D 0.2 mg·L~(-1)+NAA 1.0 mg·L~(-1)+6-BA 2.0 mg·L~(-1)+TDZ 1.0 mg·L~(-1)+蔗糖40 g·L~(-1)+谷氨酰胺100 mg·L~(-1)+植物凝胶3g·L~(-1)的培养基上,体细胞胚发生率高达66. 21%,总胚数为79个; 7%蔗糖可使体细胞胚成熟率高达64.36%,同时也可提高多子叶畸形胚形成; 2%麦芽糖+2%山梨醇+4%蔗糖组合使体细胞胚成熟率最高达88.89%,畸形胚比例最低; 30 g·L~(-1)PEG培养时,体细胞成熟率最高,为82.35%;鱼雷期的体细胞胚最合适转接,可使体胚萌发率达90.58%,复合糖上培养得到的成熟体细胞胚生根率最高,为87.47%。这为实现白刺花体细胞胚育苗奠定了理论基础,并提供了可行的方案。