Microdystrophin基因重组腺病毒的构建及转染mdx骨髓间充质干细胞的表达

构建含有人microdystrophin基因的重组腺病毒,来感染dystrophin基因敲除小鼠mdx的骨髓间充质干细胞(ＭＳＣ)进行基因修饰,为同种异体基因修饰的干细胞移植治疗ＤＭＤ疾病奠定基础。用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因。片段回收后定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pShuttle-CMV-MICRO。PmeⅠ线性化重组质粒pShuttle-CMV-MICRO,去磷酸化后回收后与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。然后将病毒上清转染DMD模型鼠mdx小鼠的骨髓间充质干细胞,通过RT-PCR以及间接免疫荧光检测microdystrophin的转录及蛋白表达。成功构建了含有microdystrophin基因的重组腺病毒,病毒滴度为5.58×10¹²vp/mL。间接免疫荧光检测可见microdystrophin蛋白在mdx小鼠MSCs中高效表达。该重组腺病毒载体的构建及成功转染到mdx MSCs内表达为下一步用microdystrophin基因修饰的mdx MSCs进行同种异体移植治疗ＤＭＤ疾病奠定了基础。     

Microdystrophin基因重组腺病毒的构建及转染mdx骨髓间充质干细胞的表达

构建含有人microdystrophin基因的重组腺病毒,来感染dystrophin基因敲除小鼠mdx的骨髓间充质干细胞(ＭＳＣ)进行基因修饰,为同种异体基因修饰的干细胞移植治疗ＤＭＤ疾病奠定基础。用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因。片段回收后定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pShuttle-CMV-MICRO。PmeⅠ线性化重组质粒pShuttle-CMV-MICRO,去磷酸化后回收后与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。然后将病毒上清转染DMD模型鼠mdx小鼠的骨髓间充质干细胞,通过RT-PCR以及间接免疫荧光检测microdystrophin的转录及蛋白表达。成功构建了含有microdystrophin基因的重组腺病毒,病毒滴度为5.58×10¹²vp/mL。间接免疫荧光检测可见microdystrophin蛋白在mdx小鼠MSCs中高效表达。该重组腺病毒载体的构建及成功转染到mdx MSCs内表达为下一步用microdystrophin基因修饰的mdx MSCs进行同种异体移植治疗ＤＭＤ疾病奠定了基础。     

腺病毒载体介导PDX-1在骨髓间充质干细胞中的表达

为研究PDX-1基因在骨髓间充质干细胞中的表达情况及生物学功能的发挥,构建了含PDX-1基因的重组腺病毒载体.酶切PDX-1基因并连入穿梭质粒pAdTrack-CMV.用电穿孔法使穿梭质粒pAdTrack-CMV-PDX-1与病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组.利用脂质体介导重组腺病毒载体转染293细胞,包装出完整的腺病毒.分离、培养、扩增骨髓间充质干细胞.用重组腺病毒感染间充质干细胞.用荧光显微镜、RT-PCR、免疫荧光染色等方法检测PDX-1、胰岛素基因及蛋白质的表达,用放射免疫分析法检测转基因细胞分泌胰岛素情况.结果表明:通过测序、PCR、酶切等鉴定PDX-1基因已正确插入穿梭质粒中,并与病毒骨架质粒重组.重组腺病毒滴度为6.3×107PFU/ml.通过荧光显微镜观察证实重组腺病毒可高效感染骨髓间充质干细胞,经RT-PCR、免疫荧光染色证实转染pAd-PDX-1后培养7天的细胞中有PDX-1及胰岛素基因的表达.这些转基因的细胞向胞外分泌的胰岛素量为(15.21±3.50)mIU/L.     

腺病毒载体介导PDX-1在骨髓间充质干细胞中的表达

为研究PDX-1基因在骨髓间充质干细胞中的表达情况及生物学功能的发挥,构建了含PDX-1基因的重组腺病毒载体. 酶切PDX-1基因并连入穿梭质粒pAdTrack-CMV.用电穿孔法使穿梭质粒pAdTrack-CMV-PDX-1与病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组.利用脂质体介导重组腺病毒载体转染293细胞,包装出完整的腺病毒.分离、培养、扩增骨髓间充质干细胞.用重组腺病毒感染间充质干细胞.用荧光显微镜、RT-PCR、免疫荧光染色等方法检测PDX-1、胰岛素基因及蛋白质的表达,用放射免疫分析法检测转基因细胞分泌胰岛素情况.结果表明:通过测序、PCR、酶切等鉴定PDX-1基因已正确插入穿梭质粒中,并与病毒骨架质粒重组.重组腺病毒滴度为6.3×10⁷ PFU/ml.通过荧光显微镜观察证实重组腺病毒可高效感染骨髓间充质干细胞,经RT-PCR、免疫荧光染色证实转染pAd-PDX-1后培养7天的细胞中有PDX-1及胰岛素基因的表达.这些转基因的细胞向胞外分泌的胰岛素量为(15.21±3.50) mIU/L.     

起搏基因体外调控骨髓间充质干细胞分化为类起搏细胞的研究

目的本研究旨在通过体外构建起搏基因质粒pIRES2-EGFP-HCN2,电穿孔转染骨髓间充质干细胞,检测其在体外的表达情况。方法对含mHCN2 cDNA的PTR载体进行转化和扩增,将所得mHCN2基因定向克隆到含有增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP中,进行双酶切来鉴定克隆的正确性。将重组质粒及空白质粒用电穿孔法转染骨髓间充质干细胞,并在体外与心肌细胞共培养,观察搏动频率变化及mHCN2的表达,并检测其电生理和组织学特征。结果构建了重组质粒pIRES2-EGFP-HCN2。荧光显微镜下可见转染后的骨髓间充质干细胞呈绿色荧光,细胞中mHCN2的阳性表达率为98.2%。免疫荧光显示转染起搏基因的骨髓间充质干细胞mHCN2的表达,而对照组无表达。实验组共培养的心肌细胞搏动频率较对照组干细胞共培养的明显增快(140±11次/分VS 100±13次/分,P0.05),动作电位显示实验组最大舒张期电位值小于对照组(-62±2mv VS-71±2mv,P0.05)。免疫荧光显示干细胞与心肌细胞间形成间隙连接。结论成功构建了重组质粒pIRES2-EGFP-HCN2,转染后的骨髓间充质干细胞可在体外成功表达功能性mH-CN2通道,提供起搏电流,具有类起搏细胞的功能,为进一步构建生物起搏器提供依据。     

人Notch1受体shRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人特异性受体Notch1短发夹RNA重组腺病毒载体,探讨其对人脐带间充质干细胞中Notch1表达的影响,以便进一步研究Notch1的生物学功能.方法:设计合成Notch1序列干扰序列,插入到pGenesil-1.1上构建重组质粒,取阳性克隆进行酶切及DNA测序鉴定.通过同源重组,构建含目的基因的重组腺病毒质粒栽体pGsadeno-Notch1-shRNA.经PacI线性化后脂质体介导转染到HEK 293细胞,包装后得到腺病毒颗粒.产生的重组腺病毒体外转染人脐带间充质千细胞,RT-PCR和Western blot 检测特异性shRNA对人脐带间充质干细胞中Notch1蛋白在mRNA及蛋白表达水平的抑制效果.结果:经酶切及DNA测序重组腺病毒质粒构建正确.重组腺病毒转染人脐带间充质干细胞3d后,RT-PCR及Western blot检测,可显著下调细胞内Notch1的转录及蛋白表达水平.对Notch1 mRNA和蛋白表达的抑制率分别为70.31％和86.97％,具有统计学意义(P＜0.05).结论:成功构建了表达人Notch1受体shRNA的重组腺病毒载体,为研究Notch1在肿瘤学中的生物学作用及机制奠定基础.     

视黄酸核受体γ重组腺病毒构建及其鉴定

目的构建携带大鼠视黄酸核受体γ（retinoic acid receptor γ,RARγ）的重组腺病毒,为研究RAR3,在骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）成神经分化中的作用奠定基础。方法体外扩增大鼠础研基因,将其定向克隆至腺病毒穿梭质粒pAd Trace—TOX构建重组质粒pAdTrace—RARγ,并在BJ5183菌中与骨架质粒pAd Easy-1重组获得腺病毒载体pad—RARγ,Pac I酶切后转染HEK293细胞包装腺病毒。腺病毒Ad—RARγ感染大鼠MSCs,Real—time PCR和Western印迹检测RARγ的表达。结果PCR,酶切及测序均证实础研正确克隆至腺病毒质粒载体中,Ad—RARγ对MSCs感染率达60％～70％,并明显增强础研基因和蛋白的表达。结论成功构建携带RARγ的重组腺病毒,并具有上调大鼠MSCsRA脚基因和蛋白表达的功能。     

脂肪储存小滴蛋白5 重组腺病毒的制备

目的:利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5(LSDP5)基因的重组腺病毒。方法:从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果:LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论:成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。     

NGF基因重组慢病毒载体的构建及其在人脐带血间充质干细胞的表达

目的:构建神经生长因子(NGF)的慢病毒表达载体,并观察其转染人脐带间充质干细胞后的表达情况。方法:采用实时定量PCR(RT-PCR)方法获取NGF基因编码片段,并将构建的慢病毒载体质粒与包装质粒和包膜质粒共转染293T细胞,包装生产慢病毒。应用相同滴度的慢病毒转导等量间充质干细胞(MSCs),观察转染后细胞的生长形态及生长曲线,再采用RT-PCR、Western Blot方法检测NGF m RNA、蛋白质的表达水平。结果:经PCR、酶切和测序结果证明成功构建NGF基因重组慢病毒载体。同时NGF基因重组慢病毒载体能够成功转染人脐带间充质干细胞,转染率达95.35%,转染后干细胞在NGF m RNA及蛋白质的表达方面较对照组明显升高,同时经倒置显微镜观察及生长曲线实验证实转染后干细胞的生长与对照组相比无明显差异。结论:重组NGF的慢病毒表达载体能够高效的转染人脐带间充质干细胞,基因转染后干细胞的增殖分化能力与未转染细胞差异无统计学意义,可作为一种高效的干细胞转染方法。     

AKT基因转染人脐带间质干细胞来源exosomes的分离及鉴定

该研究构建人AKT基因重组腺病毒载体(Ad-AKT),转染人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSC),分离hucMSC分泌的exosomes,检测exosomes中的成分变化,为exosomes的临床研究提供实验基础。该实验设计含有EcoR I、Xho I的限制性酶切位点的引物,PCR扩增AKT,将扩增产物克隆到带有绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记的穿梭质粒上。重组穿梭质粒经线性化处理后,与腺病毒骨架质粒在Stbl3中重组,筛选获得含有AKT的重组腺病毒质粒,PCR鉴定并测序。重组病毒质粒用Pac I酶切线性化,转染293A细胞,制备高效表达的Ad-AKT,并转染hucMSC。结果表明,AKT基因重组腺病毒能高效转染hucMSC,hucMSC中AKT蛋白表达增多,并且转染AKT基因的hucMSC来源的exosomes(AKT-MSC-exosomes)中AKT蛋白也增多,说明通过基因修饰可以获得过表达目的蛋白的exosomes,为exosomes的来源及应用研究提供可选择的方法。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.