耐辐射球菌转录因子DdrO 的基因克隆与生物信息学分析

目的:克隆耐辐射球菌ddrO基因,并对其进行生物信息学分析,预测其功能。方法:根据耐辐射球菌ddrO基因序列,由Primer Premier 5设计一对引物,以提取的耐辐射球菌基因组为模板,PCR扩增获得耐辐射球菌ddrO基因,序列测定并利用生物信息学软件对ddrO基因的理化性质、高级结构及生物学功能等进行分析与预测。结果:成功获得了ddrO基因。生物信息学分析发现,ddrO基因核苷酸序列长度为396bp,编码一个131aa组成的相对分子质量为14.993kD的预测的DdrO转录因子。核酸同源性搜索及比较分析仅在与耐辐射球菌同属的Deinococcus geothermalis和Deinococcus deserti中发现高度相似的序列;蛋白同源性搜索发现一些与DdrO显著同源的蛋白,如Deide₂0570（95%）,Dgeo₀336（90%）,Deide₃p02170（82%）等;结构域分析发现DdrO含有HTH（helix-turn-helix）DNA结合结构域。结论:根据生物信息学结果预测DdrO蛋白可能具有转录调控作用,参与DNA修复和复制,在耐辐射球菌的DNA损伤修复过程中发挥一定作用。     

耐辐射动球菌耐辐射及相关特性研究进展

核能的利用对于缓解能源紧张、减少温室气体排放具有重要意义,然而核能利用产生的放射性废料对环境的影响成为核能发展的掣肘。耐辐射动球菌(Kineococcus radiotolerans)是一种从核污染环境中分离出来的,可在辐射、强碱、高盐、干旱、高金属离子浓度、高渗透压及强化学毒性等严酷环境中存活的革兰氏阳性耐辐射菌,有望应用于环境生物修复、医学等领域。本文就K.radiotolerans的生理生化特性、抗辐射性、抗氧化性、抗毒性有机物等特性的研究现状进行综述。     

辐射过程中耐辐射奇球菌蛋白酶变化的检测与分析

采用明胶和酪蛋白底物酶谱法以及荧光酪蛋白底物对紫外线以及γ射线辐射后恢复期耐辐射奇球菌R1(Deinococcus radiodurans R1,DRR1)的蛋白酶变化进行了检测。结果发现,DRR1存在高活性大分子量组成性表达蛋白酶,与Karlin等［16］提出的DRR1蛋白酶为预测高表达蛋白(PHX)的设想一致。DRR1包含大量分子量大于140kD 的明胶降解酶和分子量大于120kD的酪蛋白降解酶,其中活性最高的174kD明胶酶在经SDS变性处理后仍有较高活性,该蛋白酶在DRR1受紫外线辐射和电离辐射后恢复期的表达模式存在差异,在γ射线电离辐射过程中以及电离辐射后恢复的晚期活性较高。此外,还发现一些蛋白酶特异性由辐射所诱导,表明这些蛋白酶可能参与细胞信号通路中蛋白的顺序降解,也提示DRR1损伤修复过程中细胞内存在一个精确的蛋白酶系统。这些蛋白酶的表达与细胞的营养状态相关。同时对一株由本实验室从北京地区土壤中分离到的杆状耐辐射菌RR533.2的明胶和酪蛋白蛋白酶谱进行了测定,结果发现其蛋白酶谱与DRR1相类似。     

耐辐射球菌recQ双突变株的构建及逆境分析

RecQ解螺旋酶是生物有机体在进化中高度保守的SF1超级家族解螺旋酶的一个亚族,它对维持基因组的稳定性有重要的作用。耐辐射球菌野生型菌株R1有两个具有特殊结构的解螺旋酶DR1289和DR2444,运用PCR突变法克隆具有自身groEL启动子、KAT启动子与卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因融合的DNA片段反向重组到基因组中,首次构建并鉴定了卡那霉素抗性完全突变株ΔDR1289,氯霉素抗性完全突变株ΔDR2444,双突变株ΔrecQ。辐射条件下和H2O2氧化压力下突变株生存率结果表明:ΔDR2444与R1存活率趋势线基本一致,而ΔDR1289和ΔrecQ双突变株较为敏感。根据上述结果推测,DR1289是一个对R1保持极端抗性的必须基因,而DR2444则是极端抗性的非必须基因。     

耐辐射奇球菌recA基因的克隆、表达及其对recA缺损大肠杆菌辐射抗性的影响

将耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)recA基因克隆到表达质粒pET15b中,并在Escherichia coli HMS中高效表达了可溶性的RecA重组蛋白。同时将recA基因通过穿梭质粒pRADZ3导入recA缺损E.coli TG2细胞中,Western印迹实验显示RecA蛋白能够在不需要诱导剂IPTG的条件下稳定表达。辐射抗性实验表明,D.radiodurans的recA基因在E.coli细胞中的表达能够完全补偿recA缺损E.coli辐射抗性能力。     

耐辐射奇球菌代谢产物中的化学成分

通过甲醇提取、硅胶柱色谱、重结晶分离纯化,从耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)代谢产物中分离得到五个化合物,根据光谱数据鉴定为:腺嘌呤(1),胸腺嘧啶(2),尿嘧啶(3),腺苷(4)和L-丙氨酸(5)。所有成分均为首次从该细菌的代谢产物中得到。     

类胡萝卜素在耐辐射奇球菌辐射抗性中的作用

为研究耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)中类胡萝卜素的生化合成基因及其在该细菌抗辐射机制中的生物学作用,通过有机溶剂提取及LC-MS技术分析了D. radiodurans所产类胡萝卜素物质的主要组分,运用PCR及基因同源重组技术,对该菌中类胡萝卜素生化合成途径的八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase,crtB)及八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,crtI)基因进行了缺失突变,通过表型观察及HPLC定量分析突变株所产类胡萝卜素的组分变化确证突变株构建成功．野生株及crtB 与crtI基因缺失突变株对电离辐射和H₂O₂的敏感性差异比较分析显示,和野生株相比,两种突变株对不同剂量电离辐射和不同浓度H₂O₂的敏感性更强．crtB及crtI基因功能研究表明,这两个关键性合成基因的缺失,导致突变株不能催化合成类胡萝卜素生化合成途径中的重要中间体——番茄红素及一系列下游产物．通过λ原噬菌体紫外线诱导系统、电子自旋共振 (ESR)及DMPO自旋捕集技术,分别在体内和体外评价了其类胡萝卜素的抗氧化能力．结果表明,两种类胡萝卜素对超氧阴离子(O₂^·)及羟自由基(·OH)均表现出较强的清除作用．上述研究结果为探究D. radiodurans的类胡萝卜素合成基因和生物学功能,及类胡萝卜素在D. radiodurans抗辐射机制中的作用提供了新的直接实验证据．     

耐辐射球菌基因DR1709与DR2523的突变分析

摘要：【目的】检测在耐辐射球菌抵抗外来辐射和氧自由基的过程中,锰离子转运蛋白基因（DR1709和DR2523）是否发挥了作用。探讨锰离子、锰离子转运蛋白基因与耐辐射球菌辐射抗性之间的关系。【方法】分别构建这两个基因的突变体。对突变体和野生型进行紫外线照射和过氧化氢处理。对处理后的菌株存活率进行分析。【结果】DR2523被突变以后,耐辐射球菌在tryptone-glucose-yeast extract (TGY)培养液中的生长受影响很小。而DR1709突变体M1709在对数生长阶段的生长速度远低于野生型。     

紫外辐照恢复早期耐辐射奇球菌的转录组学分析

目的 耐辐射奇球菌是一种对紫外线、电离、干燥和化学试剂具有较强抗性的极端微生物。然而,该菌在紫外辐照后恢复早期的分子响应还不完全清楚。本文的目的是揭示耐辐射奇球菌在这一阶段的转录组响应。方法 本研究采用RNA-seq技术,测定了正常和紫外辐照培养条件下耐辐射奇球菌的转录组。为确定关键的差异表达基因及其调控关系,进行了功能富集分析。选取部分关键差异表达基因,进行实时定量PCR实验验证。利用以往研究中的转录组数据,寻找紫外辐照、电离辐射和干燥胁迫条件下公共的差异表达基因。构建了蛋白质-蛋白质相互作用网络;对蛋白质互作网络中的枢纽基因和主要模块进行了鉴定;对这些枢纽基因和模块进行了功能富集分析。结果 紫外辐照后的恢复早期,上调基因数量是下调基因数量的2倍以上,且多数与应激反应和DNA修复有关。恢复早期的修复途径主要有单链退火（SSA）途径（涉及基因：ddr A-D）、非同源端连接（NHEJ）途径（涉及基因：lig B、ppr A）和核苷酸切除修复（NER）途径（涉及基因：uvr A-C）,前两种途径为同源重组（HR）做准备,而NER途径去除紫外线照射带来的嘧啶二聚体。通过比较紫外辐照、电离辐...     

耐辐射奇球菌的极端辐射抗性机制及其潜在利用

耐辐射奇球菌被誉为“地球上最顽强的细菌”,能够在超高剂量的电离辐射、长时间干旱以及外太空等极端环境中存活,其电离辐射耐受性为人类细胞的数千倍.研究表明,这种惊人的能力来源于耐辐射奇球菌所具有的超强DNA损伤修复能力以及多种高效抗氧化系统的协同作用,使其能够将同一个基因组中同时产生的高达100个以上的DNA双链断裂在数十小时内进行高效而精准的修复.因此,耐辐射奇球菌成为目前研究DNA损伤修复的重要模式生物之一.本文主要阐述了耐辐射奇球菌的起源、细胞结构特征、DNA双链断裂修复机制以及抗氧化系统,展现了其对于极端环境的适应机制,并对其在放疗和基础生物学研究、抗逆调控元件的开发以及放射性核素富集等领域的应用前景进行了展望.     

日本蛇根草花青素还原酶基因的克隆及其生物信息学分析

花青素还原酶(anthocyanidin reductase, ANR)是原花青素合成途径中的关键酶,同时花青素还原酶对植物花色苷的积累也发挥着重要作用。本研究以日本蛇根草为材料,以其转录组测序结果为基础,设计引物通过RT-PCR方法成功克隆得到日本蛇根草ANR基因完整的cDNA序列,利用生物信息学方法和工具对日本蛇根草ANR基因的功能结构域、生理和化学参数、亲/疏水性、信号肽、二级结构等进行预测和分析。结果表明,该基因cDNA全长为1 020 bp,编码339个氨基酸,预测其蛋白分子量为36.37 kD,等电点为5.92,为亲水蛋白,不含信号肽序列。综上,本研究成功克隆获得日本蛇根草ANR基因并完成其生物信息学分析,研究结果将为解析该基因的功能奠定基础。     

D.radiodurans CatB基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

通过生物信息学方法从耐辐射奇球菌（Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）全基因组居库中查鼠并克隆了编码过氧化氢酶（Ｃａｒｔａｌａｓｅ,Ｃａｔ）的１６１１ｂｐ长ＣａｔＢ基因,将ＣａｔＢ基因连人ｐＫＫ２２３－３表达载体,转化Ｃａｔ酶链陷型大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＵＭ２）。转化菌裂解液ＰＡＧＥ酶活性染色分析实物具有Ｃａｔ酶活性,电泳过移位置与ＣａｔＢ位置相符。Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ ＣａｔＢ基因的表达可使Ｅ．     

樟叶越桔熊果苷合成酶基因VdAS1的克隆及序列分析?

根据樟叶越桔( Vaccinium dunalianum)叶芽转录组测序获得的熊果苷合成酶基因VdAS1部分EST序列设计引物,结合RACE￣PCR技术获得VdAS1基因全长1577 bp cDNA序列。其完整的开放阅读框推测编码由475个氨基酸残基组成的VdAS1蛋白,理论相对分子量为52?22 kD,等电点pI＝5?74,负电荷残基( Asp＋Glu)总数为53个,正电荷残基( Arg＋Lys)总数为45个,不稳定系数为37?93,属稳定性蛋白质。生物信息学分析表明VdAS1与枸杞的糖基转移酶相似率高达74％,其二级结构主要构件为α￣螺旋和随机卷曲,不存在跨膜区,属于亲水性蛋白质,并结合信号肽预测结果推测VdAS1直接锚定在细胞基质中行使功能。该研究为后期VdAS1的异源表达和功能研究奠定了基础。     

Role of RecA in DNA damage repair in Deinococcus radiodurans

It has been shown previously that the RecA protein of Deinococcus radiodurans plays a unique role in the repair of DNA damage in this highly DNA damage-resistant organism. Despite the high level of amino-acid identity, previous work has shown that Escherichia coli RecA does not complement D. radiodurans RecA mutants, further suggesting the uniqueness of D. radiodurans RecA. The work presented here shows that E. coli RecA does in fact provide partial complementation to a D. radiodurans RecA null mutant, suggesting that the RecA protein from D. radiodurans may not be as unique as believed previously.     

平榛AGAMOUS基因的克隆与生物信息学分析

以野生平榛(Corylus heterophylla Fischer)为试材,采用RT-PCR方法从花芽中获得了一个平榛AGAMOUS基因cDNA,命名为ChAG,GenBank登录号为JN828811.序列分析结果表明,ChAG基因编码一个长度为726 bp,编码241个氨基酸的开放阅读框.氨基酸序列分析显示,该基因属于MADS家族AG亚家族.序列比对和系统进化分析表明,ChAG基因与欧榛的亲缘关系最近,相似性达99％.采用生物信息学手段对ChAG基因的保守结构域、疏水性和二级结构等进行分析.     

生物信息学在新基因全长cDNA电子克隆中的应用

新基因全长cDNA序列的获得常常是生物学工作者面临的难题,电子克隆是利用生物信息学手段得到新基因全长cDNA序列的新方法。介绍了电子克隆的方法及其生物信息学在其间的具体应用,并概述了一些生物信息学在序列分析中的应用。     

耐辐射奇球菌dps突变株的构建和蛋白功能初步研究

Dps(DNAprotection during starvation)蛋白是原核生物中特有的一类具有铁离子结合和抗氧化损伤功能的重要蛋白。利用体外PCR扩增技术和体内同源重组方法,获得了耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)dps全基因(DRB0092)缺失突变株。对突变株和野生型分别进行不同浓度过氧化氢(H2O2)处理,结果表明:与野生型菌株R1相比,dps突变株在低浓度H2O2(≤10mmol/L)条件下存活率急剧下降,而高浓度(≥30mmol/L)下则完全致死。Native-PAGE活性染色结果显示,稳定生长期dps突变株体内两种过氧化氢酶(KatA和KatB)的活性较野生型R1分别上调2.3倍和2.6倍。通过质粒构建和大肠杆菌诱导表达,获得可溶性Dps蛋白。体外结合和DNA保护实验结果显示:Dps具有明显的DNA结合功能,并能保护质粒DNA免受羟自由基攻击。本研究证明,Dps蛋白在耐辐射奇球菌抗氧化体系中发挥重要作用,可能对该菌极端抗性机制有重要贡献。     

A new role of Deinococcus radiodurans RecD in antioxidant pathway

In Deinococcus radiodurans, RecBCD holoenzyme is not intact because of the absence of RecB and RecC, but a RecD-like protein does indeed exist. In this work, D. radiodurans recD disruptant was constructed and its possible biological functions were investigated. The results showed that disruption of the recD gene of D. radiodurans resulted in a remarkably increased sensitivity to hydrogen peroxide but had no apparent effect on the resistance to gamma and UV radiation. Furthermore, complementation experiments showed that Escherichia coli RecD, helicase domain or N-terminal domain of D. radiodurans RecD could not individually restore the resistant phenotype to hydrogen peroxide of the recD disruptant, whereas the complete D. radiodurans RecD protein could. Further studies showed that D. radiodurans RecD took part in antioxidant process by stimulating catalase activity and reactive oxygen species scavenging activity in D. radiodurans. These results suggest that D. radiodurans RecD has a new role in the antioxidant pathway.