稳定性同位素探测技术在微生物生态学研究中的应用

稳定性同位素标记技术同分子生物学技术相结合而发展起来的稳定性同位素探测技术（stableisotope probing,SIP）,在对各种环境中微生物群落组成进行遗传分类学鉴定的同时,可确定其在环境过程中的功能,提供复杂群落中微生物相互作用及其代谢功能的大量信息,具有广阔的应用前景.其基本原理是：将原位或微宇宙（microcosm）的环境样品暴露于稳定性同位素富集的基质中,这些样品中存在的某些微生物能够以基质中的稳定（性同位素为碳源或氮源进行物质代谢并满足其自身生长需要,基质中的稳定性同位素被吸收同化进入微生物体内,参与各类物质如核酸（DNA和RNA）及磷脂脂肪酸（PLFA）等的生物合成,通过提取、分离、纯化、分析这些微生物体内稳定性同位素标记的生物标志物,从而将微生物的组成与其功能联系起来.在介绍稳定性同位素培养基质的选择及标记方法、合适的生物标志物的选择及提取分离方法的基础上,举例阐述了此项技术在甲基营养菌、有机污染物降解菌、根际微生物生态、互营微生物、宏基因组学等方面的应用.     

分子微生物生态学及其研究进展

分子微生物生态学是分子生物学实验技术应用于微生物生态学研究领域而发展形成的一门交叉学科,在研究微生物生态系统组成结构、功能的分子机理以及微生物与生物和非生物环境之间相互关系等方面显示了巨大的潜力．十几年来分子微生物生态学研究所取得的成就证明：分子生物学研究技术向微生物生态学领域的不断渗透,为微生物生态学研究领域注入了新的活力,尤其在微生物多样性、微生物区系分子组成及变化规律以及微生物系统进化研究方面取得了重大突破．本文根据近年分子微生物生态学的研究进展,就分子微生物生态学概念的提出、发展历程、主要研究领域、主要研究方法以及未来研究热点领域作以简要综述。     

分子生物学方法在环境微生物生态学中的应用研究进展

随着分子生物学方法的不断发展和改进,微生物在生态系统中的作用被更好的挖掘出来。目前快速发展的先进的分子生物学技术,已经开始应用于分析环境微生物的多样性、微生物的生物地理学及微生物对气候变化的响应等。一般环境微生物的研究目标主要有3个,即确定微生物的种类和多样性、微生物的功能或潜在作用及在特定时间点活跃的微生物等。然而,现有微生物的研究方法复杂多样,容易给研究者在方法的选择上带来困惑。将从微生物的多样性和功能研究两个方面介绍和分析相应的分子生物学方法,尤其是近年来快速发展的高通量测序、宏组学和单细胞水平研究方法(如纳米二次离子质谱与荧光原位杂交相结合的方法)等新技术及其应用情况,以期为研究者选择合适的研究方法进行环境微生物的研究提供依据。     

Plant species and soil type cooperatively shape the structure and function of microbial communities in the rhizosphere

The rhizosphere is of central importance not only for plant nutrition, health and quality but also for microorganism-driven carbon sequestration, ecosystem functioning and nutrient cycling in terrestrial ecosystems. A multitude of biotic and abiotic factors are assumed to influence the structural and functional diversity of microbial communities in the rhizosphere. In this review, recent studies on the influence of the two factors, plant species and soil type, on rhizosphere-associated microbial communities are discussed. Root exudates and the response of microorganisms to the latter as well as to root morphology were shown to shape rhizosphere microbial communities. All studies revealed that soil is the main reservoir for rhizosphere microorganisms. Many secrets of microbial life in the rhizosphere were recently uncovered due to the enormous progress in molecular and microscopic tools. Physiological and molecular data on the factors that drive selection processes in the rhizosphere are presented here. Furthermore, implications for agriculture, nature conservation and biotechnology will also be discussed.     

变性梯度凝胶电泳(DGGE)在微生物生态学中的应用

由于从环境样品中分离和培养细菌的困难,分子生物学方法已发展用来描述和鉴定微生物群落。近年来基于DNA方法的群落分析得到了迅速的发展,如PCR扩增技术,克隆文库法,荧光原位杂交法,限制性酶切片段长度多态性法,变性和温度梯度凝胶电泳法。DGGE已广泛用于分析自然环境中细菌、蓝细菌,古菌、微微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多样性。这一技术能够提供群落中优势种类信息和同时分析多个样品。具有可重复和容易操作等特点,适合于调查种群的时空变化,并且可通过对切下的带进行序列分析或与特异性探针杂交分析鉴定群落成员。DGGE分析微生物群落的一般步骤如下：一是核酸的提取,二是16S rRNA,18S rRNA或功能基因如可容性甲烷加单氧酶羟化酶基因(mmoX)和氨加单氧酶a一亚单位基因(amoA)片段的扩增,三是通过DGGE分析PCR产物。DGGE使用具有化学变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶,该凝胶能够有区别的解链PCR扩增产物。由PCR产生的不同的DNA片段长度相同但核苷酸序列不同。因此不同的双链DNA片段由于沿着化学梯度的不同解链行为将在凝胶的不同位置上停止迁移。DNA解链行为的不同导致一个凝胶带图案,该图案是微生物群落中主要种类的一个轮廓。DGGE使用所有生物中保守的基因片段如细菌中的16S rRNA基因片段和真菌中的18S rRNA基因片段。然而同其他分子生物学方法一样,DGGE也有缺陷,其中之一是只能分离较小的片段,使用于系统发育分析比较和探针设计的序列信息量受到了限制。在某些情况下,由于所用基因的多拷贝导致一个种类多于一条带,因此不易鉴定群落结构到种的水平。此外,该技术具有内在的如单一细菌种类16S rDNA拷贝之间的异质性问题,可导致自然群落中微生物数量的过多估计。DGGE是分析微生物群落的一种有力的工具。不过为了减少DGGE和其它技术的缺陷,建议研究者结合DGGE和其它分子及微生物学方法以便更详细的观察微生物的群落结构和功能。     

Risk Assessment,Microbial Communities,and Pollution-Induced Community Tolerance

Until recently, parameters from microorganisms were generally not included in risk assessment at a comparable level to animals and plants. However, the major part of global biomass, biodiversity, and ecosystem processes is present in the microbial world and microbiological techniques applicable to risk assessment are becoming available. Two microbial indicators are described based on the usage of multiwell plates with different substrates and a redox indicator for monitoring mineralisation. With both techniques autochthonous microbial communities are analysed. Producing functional fingerprints of the microbial community gives insights into the composition of different functions. This is equivalent to observations of ecological abundance and species composition. When lack of reference sites or reference data renders risk assessment difficult, measurement of the pollution-induced community tolerance (PICT) can provide useful information.     

油藏微生物群落研究的方法学

油藏微生物群落的解析和认知是开发和应用微生物采油技术的基础。利用各种提高油藏微生物可培养性的方法和非培养技术解析不同油藏微生物的群落结构、功能和多样性,对定向调控油藏微生物群落、开发和应用有效微生物驱油技术具有重要的指导意义。通过调查新近发展的提高微生物可培养性的方法和措施以及不依赖于培养的分子微生物生态学技术,总结了油藏微生物群落研究方法学的最新进展。提高微生物可培养性的方法和措施主要通过模拟微生物的生存环境,减少富营养的毒害作用、添加信号分子维持微生物细胞间的作用和提供新型电子供体和受体等手段采用稀释法、高通量培养法等方法得以实现;不依赖于培养的分子微生物生态学技术主要包括荧光原位杂交、末端限制性片断长度多态性分析、变性梯度凝胶电泳和构建克隆文库等技术。这些方法学的进展为更有效的获得各种油藏微生物资源、调控油藏微生物群落以提高石油采收率提供理论指导。     

元蛋白质组学在微生物功能研究中的应用

后基因组时代,仅依靠基因组方法来研究原位微生物群落的功能已远远不够,在这种背景下元蛋白质组学研究逐渐兴起。应用元蛋白质组学技术可大规模研究原位微生物群落的蛋白质表达,分析生态系统中微生物的功能,寻找新的功能基因和代谢通路,为微生物群体的基因和功能多样性研究提供数据。同时,还可鉴定与微生物功能相关的蛋白质,这些蛋白质未来可以作为生物标记物为环境可持续发展铺路。综述了元蛋白质组学的发展概况及其在微生物功能研究中的重大作用,强调了元蛋白质组学方法在分析新功能基因及其相关基因,揭示微生物多样性与微生物群体功能之间的关系等方面起到的作用,并对其应用前景进行了展望。     

Application of multivariate statistical techniques in microbial ecology

Recent advances in high‐throughput methods of molecular analyses have led to an explosion of studies generating large‐scale ecological data sets. In particular, noticeable effect has been attained in the field of microbial ecology, where new experimental approaches provided in‐depth assessments of the composition, functions and dynamic changes of complex microbial communities. Because even a single high‐throughput experiment produces large amount of data, powerful statistical techniques of multivariate analysis are well suited to analyse and interpret these data sets. Many different multivariate techniques are available, and often it is not clear which method should be applied to a particular data set. In this review, we describe and compare the most widely used multivariate statistical techniques including exploratory, interpretive and discriminatory procedures. We consider several important limitations and assumptions of these methods, and we present examples of how these approaches have been utilized in recent studies to provide insight into the ecology of the microbial world. Finally, we offer suggestions for the selection of appropriate methods based on the research question and data set structure.     

非培养方法在土壤微生物生态学研究中的应用

由于有相当数量的土壤微生物是目前不可培养的,因此利用传统培养技术来研究土壤微生物,不仅费时费力,所得到的结果可能和真实的情况相差甚远。近年来发展了三类不需培养的方法来研究土壤微生物的种类和数量,这些方法大体上分为生物化学、生理学和分子生物学三类。生物化学方法主要根据细胞膜磷脂酸(PLFA)的种类和数量来判定微生物的多样性;BIOLOG微量板分析系统是生理学方法的代表,它主要是根据土样细胞悬液对95种单一碳源的利用模式来说明群落结构的变化;分子生物学方法是发展应用最广的方法。基本步骤是提取土壤的总DNA,然后用通用引物或选择性高的引物来扩增16SrRNA基因。由于对扩增产物分析方法的不同,该方法又可分为PCR-DGGE,PCR-RFLP等。最近在PCR-RFLP基础上发展起来的T—RFLP分析方法,将微生物的多样性分析工作同RDP(ribosomal database project)数据库结合,充分利用了Internet的数据资源共享的优势,具有分辨率高,可实现自动化等优点。是未来土壤微生物生态学研究的有力工具。