重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)腺相关病毒qPCR检测方法的验证

目的 对重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR, qPCR)检测方法进行验证。方法 以基因组两末端的反向末端重复序列(inverted terminal repeat, ITR)为目的基因,对重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)的腺相关病毒进行qPCR检测。对该方法进行线性范围、重复性、准确度、中间精密度、定量限、耐用性和适用性验证。结果 AAV浓度在2×10²～2×10⁷ copies/μL范围内线性良好(R²>0.999);重复性验证CV<10%;准确度验证回收率在91%～114%;中间精密度验证CV<10%;定量限为100 copies/μL;耐用性验证CV<10%;并且3种不同重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)均未检出腺相关病毒。结论 重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)腺相关病毒qPCR检测方法的线性范围、重复性、准确度、中间精密度、定量限和耐用性均符合可接...     

重组腺相关病毒生产方法研究进展

重组腺相关病毒(rAAV)作为基因治疗的载体,具有感染范围广、能在宿主细胞中长久稳定表达外源基因和非致病性等优点,因此在基因治疗领域倍受青睐。rAAV的大规模制备技术一直是限制其临床广泛应用的瓶颈。近年来,有许多改进rAAV制备工艺的尝试。我们在介绍rAAV载体制备所需各种元件的基础上,对这些方法进行了简要综述。     

重组腺相关病毒包装容量研究进展

在以病毒载体介导的基因治疗研究中,重组腺相关病毒(rAAV)因其疗效和安全性方面的优势,是最有临床应用前景的载体。但其转基因包装容量一般不能超过5.0kb,给需要转导大片段基因的应用带来了困难,限制了rAAV在基因治疗研究中的应用。随着对rAAV细胞转导生物学过程研究的不断深入,发现了一些可以突破rAAV包装容量限制的技术,如反式剪接和同源重组策略,为拓展该载体应用范围提供了可能性。另外,rAAV包装容量限制的特点还可以被用来减少生产过程中具有可复制能力的类病毒杂质的污染,为rAAV的临床安全性提供了保障。     

重组腺相关病毒载体相关性杂质

可以稳定表达治疗基因而无明显不良反应的重组腺相关病毒 (rAAV) 载体被认为是最有发展前景的基因治疗载体。但如何建立可以有效去除rAAV载体内具有潜在致病危害的杂质、产品质量符合临床使用要求的纯化工艺是研究人员面临的巨大挑战。其中针对载体相关性杂质的纯化工艺尤为关键,因为该类杂质的性质与真正的rAAV载体极其相似,一旦存在便难以去除,且会引起严重不良反应。以下总结了该类杂质形成的过程及有别于rAAV载体的特点,并对可以防止其生成或将其与rAAV载体有效分离的技术手段进行了评价。     

重组腺相关病毒载体相关性杂质

可以稳定表达治疗基因而无明显不良反应的重组腺相关病毒(rAAV)载体被认为是最有发展前景的基因治疗载体。但如何建立可以有效去除rAAV载体内具有潜在致病危害的杂质、产品质量符合临床使用要求的纯化工艺是研究人员面临的巨大挑战。其中针对载体相关性杂质的纯化工艺尤为关键,因为该类杂质的性质与真正的rAAV载体极其相似,一旦存在便难以去除,且会引起严重不良反应。以下总结了该类杂质形成的过程及有别于rAAV载体的特点,并对可以防止其生成或将其与rAAV载体有效分离的技术手段进行了评价。     

重组腺相关病毒：很有潜力的基因治疗载体

腺相关病毒(AAV)是细小病毒家族的一员,为无包膜的线性单链DNA病毒.由于AAV具有长期潜伏于人体而不具有任何明显致病性等优点,人们对AAV作为一种理想的基因治疗载体给予了很大期望.但是,近来发现,这类载体在应用上有许多明显的缺陷,包括某些细胞膜上病毒受体数量极少,重组AAV载体位点特异性整合不足,AAV衣壳成分和转基因产物引起宿主的免疫反应等等.这些缺陷促使人们加大对AAV生物学特性和转染过程的研究,从而更好地对AAV载体进行改进,使新一代重组AAV载体具备基因治疗所必需的安全性、高效性和靶向性,以期更广泛地应用于临床.     

腺相关病毒载体基因治疗的研究进展

腺相关病毒 (ＡＡＶ)属于病毒中最小、也是最简单的一种———细小病毒属 ,它是一种有缺陷的非致病性的人类细小病毒 ,重组的腺相关病毒 (ｒＡＡＶ)作为基因治疗的载体 ,对长期基因矫正和基因治疗具有优越性。新的生产工艺提高了ｒＡＡＶ的滴度 ,去除了腺病毒的污染 ,并构建了适用于不同靶细胞的可诱导载体。这些改进有望加速进一步的动物实验研究 ,使临床治疗人类疾病早日成为可能。1 .ｒＡＡＶ的制备方法在 1 989年 ,首次产生了没有野生型ＡＡＶ帮助复制的重组的ＡＡＶ ,这以后 ,为了增加病毒颗粒数 ,人们制造了许多ＡＡＶ辅助质粒 ,其中…     

重组腺相关病毒载体在肝疾病基因治疗中的应用及局限性

基因治疗(gene therapy)是近十年来随着现代分子生物学技术的发展而诞生的新的生物医学治疗技术.重组腺病毒伴随病毒是一种具有开发潜质的病毒载体,因此近年来对它的研究很是受人关注.肝炎、肝硬化、肝癌在我国乃至全世界是严重损害人们的健康,据此,国内外的研究人员对rAAV在肝疾病基因治疗方面做了大量的工作,本文对rAAV在肝疾病基因治疗中的应用和局限性研究进行综述.     

重组腺相关病毒载体临床实验研究

重组腺相关病毒载体 (rAAV)基因药物已经开展六十余项（67）临床研究,其安全、高效、稳定、表达持久等特点越来越受到业界的重视,最近的临床试验发现其在治疗先天性黑内障临床研究中呈现出显著疗效更是极大地振奋了人们的信心。临床研究案例的增加使人们对rAAV基因药物有了更为全面、深入的认识。与此同时,也对基因药物提出了更多挑战与要求,尤其是免疫原性和安全性等方面。     

腺相关病毒载体与中枢神经系统的基因治疗

本文对ＡＡＶ的分子生物学结构,重组和其对细胞的整合及ｒＡＡＶ载体在基因治疗中的作用,尤其是ｒＡＡ载体在中枢神经系统疾病基因方面的最新应用作了较全面阐述。     

2型重组腺相关病毒体外转导培养细胞的研究

为揭示2型重组腺相关病毒感染哺乳动物细胞的一些转导特征,构建并制备了一种携带萤火虫荧光素酶基因的重组2型腺相关病毒rAAV2-Luc,研究了该重组病毒体外转导哺乳动物细胞的量效关系;肝素对转导的拮抗作用;rAAV2的竞争抑制作用;丁酸钠对表达水平的增强作用.结果显示,在一定范围内,随着rAAV2-Luc感染细胞的感染复数(MOI即每个细胞感染的病毒基因组数)值增高,荧光素酶的表达水平也增高;但更高的MOI(＞107)反而使荧光素酶的表达水平下降.肝素可特异性阻断rAAV2介导的荧光素酶表达.携带不同基因的2种rAAV2病毒相互具有明显的竞争抑制作用.丁酸钠可显著增强rAAV2介导的荧光素酶表达水平.本研究对rAAV2载体介导的基因转移研究具有一定的指导意义.     

重组腺相关病毒载体诱导的天然免疫反应及机制

重组腺相关病毒(rAAV)已成为基因治疗领域应用最广泛的载体之一。临床前研究显示其具有很高的安全性,但人体免疫毒性仍是制约其临床疗效的关键,因此有关rAAV免疫机制的研究成为近期热点。尽管天然免疫在获得性免疫反应中发挥重要作用,但与rAAV有关的天然免疫研究过去一直未被重视。直到最近,才确认有至少3种人体细胞(树突状细胞、巨噬细胞和内皮细胞)参与了rAAV的天然免疫,作用机制为可识别载体基因组的TLR9或病毒衣壳TLR2所介导,NF-κB或干扰素调节因子(IRFs)信号通路被激活,导致各种炎性因子及I型干扰素的大量表达。自身互补型rAAV诱导的TLR9依赖性天然免疫较单链rAAV更为强烈。本文重点对近期发现的激活天然免疫反应的宿主与rAAV的相互作用、涉及的信号通路、天然免疫对获得性免疫以及转基因表达的影响进行综述。     

Tet-On调控HSVtk表达的重组腺相关病毒载体的构建和感染活性的检测

构建含有Tet基因调节系统及自杀基因HSVtk的重组腺相关病毒载体pAAV TRE HSVtk Tet_On ,并使用PCR技术和限制性内切酶消化进行鉴定。用构建好的重组质粒分别与辅助质粒pAAV_RC、pHelper以磷酸钙共沉淀法转染HEK2 93细胞,进行病毒包装后得到了AAV TRE HSVtk Tet_On重组腺相关病毒,以氯化铯密度梯度离心对包装好的病毒进行纯化。用纯化后的重组腺相关病毒感染乳腺癌细胞株MCF_7后,斑点杂交检测结果显示,HSVtk基因整合进入MCF_7细胞基因组中。有感染活性的重组腺相关病毒能将目的基因转移到宿主细胞中,在Dox诱导下,GCV对AAV感染的MCF_7细胞具有明显的杀伤作用。     

重组腺伴随病毒载体介导的hEPO转移及表达

为实现人促红细胞生成素 (humanerythropoietin ,hEPO)基因在体内的持续表达 ,构建了携带hEPO的重组腺伴随病毒 (recombinantadeno associatedvirus,rAAV)载体质粒 ,建立了稳定携带hEPO表达盒的rAAV载体细胞株 ,采用“一种辅助病毒感染一个载体细胞株”的rAAV生产策略 ,制备并纯化了携带hEPO的rAAV(rAAV hEPO)。结果表明 ,rAAV介导的hEPO转移能够使hEPO在培养的BHK 2 1细胞中得到有效表达 ;用rAAV hEPO对Balb/c小鼠进行一次肌肉注射 ,可使hEPO在小鼠体内持续表达 10周以上 ,并可明显升高小鼠的红细胞比容