利用wx基因分子标记辅助选择培育糯性小麦

利用中国春及其缺体-四体对wx-B1基因的STS标记和wx-A1、wx-D1的微卫星(SSR)标记进行了定位.联合应用这2种分子标记,对12个小麦品种和5个高代糯麦株系做了鉴定,与Wx蛋白的SDS-PAGE结果一致;从组合江苏白火麦×关东107的F2分离群体中筛选出8种wx基因型,其中3种基因型(AD同缺型,BD同缺型和糯型)为自然界中所没有,并且培育出了国内首批糯性小麦品系.另外,应用SSR标记对江苏白火麦回交改良群体中个体进行辅助选择,得到了含wx-D1b的7D单体,为将来进一步改良糯性小麦的农艺性状提供广泛的遗传材料.利用wx基因分子标记辅助选择,可以加速培育糯性小麦的进程.     

青海糯性春小麦综合标记辅助育种研究

选用全糯小麦品种‘糯麦1号’与青海主要栽培品种‘阿勃’杂交,综合利用改良碘染色法、SDS-PAGE法和Waxy基因的分子标记等,对杂交后代进行了鉴定筛选。最终从F2代鉴定出了5粒全糯种子,从F3代鉴定出8株Wx-B1亚基缺失的植株。对全糯株系F3代的农艺性状进行评价,5个全糯株系的综合农艺性状都优于‘糯麦1号’,与‘阿勃’较接近。测定全糯株系和Wx-B1亚基缺失植株F4代种子的直链淀粉含量,5个全糯株系F4代种子的直链淀粉含量接近于0,8个Wx-B1亚基缺失植株F4代种子的直链淀粉含量在总体上比‘阿勃’的直链淀粉含量低。研究表明,采用综合标记辅助选择可快速而准确地获得适合在青海栽培的全糯和部分糯性小麦。     

利用回交结合Wx基因分子标记培育部分糯性小麦

颗粒结合型淀粉合成酶Ⅰ(GBSSI,Waxy蛋白)是小麦胚乳中直链淀粉合成的关键酶。小麦基因组中存在3个Waxy基因(Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1)。在白火麦中Wx-D1位点的突变(Wx-D1b)引起Wx-D蛋白的缺失,导致直链淀粉含量下降,其面粉表现出部分糯性。与目前生产上推广品种相比,白火麦的农艺性状较差,产量非常低。为了培育农艺性状优良的部分糯性小麦,我们将白火麦与具有优良农艺性状的小麦品种PH85-16、济南17和烟农15(轮回亲本)分别进行杂交,后代分别与相应的三个轮回亲本回交五代,在每代中均选择农艺性状与轮回亲本相近并含有Wx-D1b的后代。在第六代自交后选择具有Wx-D1b的纯合体,选出的单株连续自交三代。获得了六个农艺性状与轮回亲本相似的品系,它们均携带纯合的Wx-D1b位点。研究表明采用回交的方法并结合基于Wx基因序列的分子标记技术,是培育优良部分糯性小麦的一种非常有效的方法。本研究培育出的部分糯性小麦品系可以直接用于大田生产。     

中国糯小麦研究进展

由于糯小麦缺失(Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1)3对蜡质基因,其直链淀粉含量低于1%,因此在食品工业和非食品工业中有着巨大的应用价值.自20世纪90年代以来,糯小麦研究已成为国际热点.虽然我国开展糯小麦研究起步较迟,但在糯小麦Wx基因资源的筛选、糯小麦的遗传和育种、糯小麦淀粉品质评价等方面取得了较快的进展.本文就中国在上述领域的研究进展作一综述,并就糯小麦研究提出几点建议.     

多种优质高分子量谷蛋白亚基的聚合育种研究

用携带HMW-GS14 15的小偃6号作为轮回亲本,携带HMW-GS5 10的法国优质面包小麦品系707作为供体亲本,在回交后代的BC1、BC2、BC3、BC3F1、BC3F2代其它农艺性状选择的基础上,利用1对特异引物逐代检测出携带优质,Dx5基因的单株进行回交和自交。BC1代中随机检测的58个单株的Dx5基因分布符合1对等位基因的遗传分离比例1：1;BC1代小麦相同3个单株3个不同生长季节Dx5基因检测的结果完全一致,检测结果非常稳定;已将优质Dx5基因导入BC3F2后代的部分单株内;携带Dx5基因的株系XN89-7-3微量SDS沉淀值为18．8mL,比小偃6号提高了23．68％;蛋白质电泳筛选出了6个聚合多种优质亚基且编码基因纯合的单株,微量SDS沉淀值为19．9mL,比小偃6号提高了30．92％;选择农艺性状与轮回亲本相似并具有Dx5基因特异扩增产物的单株进行回交或自交,可加快回交转育的进度。实践证明,回交转育与分子标记辅助选育相结合的育种方法是快速定向聚合多种优质HMW-GS基因的有效方法之一。     

利用分子标记辅助选择改良珍汕97的稻瘟病抗性

利用回交育种中产生的回交群体,结合前人的研究结果构建了Pil基因区域的局部分子标记连锁图,通过BC1F2家系的接种结果判断其基因型.将Pi1定位在RFLP标记RZ536与SSR标记RM144之间,图距分别为9.7cM、6.8 cM,从而建立了一套完整的以PCR为基础的分子标记辅助选择体系.通过分子标记和抗性验证两种选择方式相结合,经过三代回交将Pi1区段快速导入受体亲本珍汕97B中.在BC3F1中利用15条ISSR引物扩增的167条随机分布在基因组中的多态性带筛选背景,得到4个背景较好的单株.经过纯合筛选及抗性验证后共得到17个带有抗性基因Pi1的改良珍汕97株系.试验表明微卫星标记在正向选择、负向选择及背景选择中都起到极大的作用.     

利用分子标记辅助选择改良珍汕97的稻瘟病抗性

利用回交育种中产生的回交群体，结合前人的研究结果构建了Pi1基因区域的局部分子标记连锁图，通过BC1F2家系的接种结果判断其基因型。将Pi1定位在RFLP标记RZ536与SSR标记RM144之间，图距分别为9．7cM、6．8cM，从而建立了一套完整的以PCR为基础的分子标记辅助选择体系。通过分子标记和抗性验证两种选择方式相结合，经过三代回交将Pi1区段快速导入受体亲本珍汕97B中。在BC3F1中利用15条ISSR引物扩增的167条随机分布在基因组中的多态性带筛选背景，得到4个背景较好的单株。经过纯合筛选及抗性验证后共得到17个带有抗性基因Pi1的改良珍汕97株系。试验表明微卫星标记在正向选择、负向选择及背景选择中都起到极大的作用。     

小麦糯性基因的多重PCR分子鉴定

采用多重 PCR 的方法, 对其反应条件进行优化, 以获得用于小麦糯性(Wx)基因分析的稳定PCR体系。应用两对引物, 分别扩增小麦 Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1 基因, 目的片段大小分别为: 230 bp/265 bp、854 bp和 204 bp。经反复验证, 结果准确可靠, 重复性好, 成本低, 可以在同一PCR反应体系中对 3 个Wx 基因进行同时筛选鉴定。该体系可用于 Wx 蛋白基因的分子标记辅助选择, 可以提高小麦淀粉品质评价和糯麦选育的效率。     

分子标记辅助选育抗水稻条纹叶枯病的‘红血糯’种质

为了改良水稻‘红血糯’品种对条纹叶枯病的抗性,将‘秦稻2号’、‘香糯Q33’、‘青香糯’作为抗性的供体亲本配制杂交组合;同时选取了ST10、H21和STS11-43等3对显性分子标记用于亲本和F2群体田间抗病性的分子标记辅助检测。结果显示:(1)不同分子标记在亲本中的多态性不同,标记H21和STS11-43只有在‘红血糯’和‘香糯Q33’之间具有多态性,标记ST10在‘红血糯’与‘秦稻2号’、‘香糯Q33’、‘青香糯’之间都有多态性。(2)各个分子标记在不同杂交组合F2群体的室内分子检测显示,部分F2单株携带抗性基因条带,也有个别单株含有杂合抗病基因条带。(3)田间发病抗性检测显示,含有抗性基因的植株基本不发病,携带抗性基因的单株与田间发病情况调查结果基本相符,但对含有杂合抗病基因条带的抗病单株,其还需2~3代田间观察,纯化抗病基因。研究表明,分子检测结果与田间抗病性检测结果相符,3种分子标记可以用于‘红血糯’杂交后代的分子标记辅助检测,为改良‘红血糯’的条纹叶枯病抗性育种提供了可行的方法。     

粘类小麦雄性不育恢复基因的遗传分析及RAPD标记

利用RAPD分子标记对粘类小麦雄性不育系ms（Kots）-90-110的恢复系Rk5451的恢复基因进行了标记定位。选取具有高恢复力的恢复系康本材料Rk5451和Rk5253为父本与ms（Kots）-90-110杂交．F1代再与保持系90-110回交;以90-110／／ms（Kots）-90-110／Rk5451的BC1F1代分离群体为研究对象．利用分离群体分组分析法（Bulked Segregant Analysis．BSA）．以350个随机引物对Rk5451的主效恢复基因进行RAPD分析．筛选到27个可在亲本间扩增出多态性的引物．其中引物S120经多次重复能在亲本间及不育和可育池间扩增出稳定的多态性片段S120-1745。     

籼稻转反义蜡质基因后代的直链淀粉含量测定和纯系选育

通过根癌农杆菌介导将反义蜡质基因导入籼型雄性不育保持系龙特甫B中,获得30个PCR检测为阳性的转基因植株,其中,28个为Southern检测阳性。T1种子直链淀粉含量测定结果表明,有21个转基因植株比龙特甫B明显下降,下降幅度为3％-13％,并在部分转基因植株的种子中观察到蜡质状籽粒;对6个转基因植株进行了不同世代的直链淀粉含量测定,在L3和L5的T4代中,选择到直链淀粉含量分别为15．9％和8．4％的纯合株系,经凝胶电泳测定,WX蛋白量明显降低,并与直链淀粉含量下降表现一致。以L3-1-1-1(15．9％)和L5-8-2-1(8．4％)纯合株系为亲本,分别与龙特甫A进行成对杂交和回交,并测定了F1和B1F1种子直链淀粉含量,以L3-1-1-1作亲本的F1为21．4％,B1F1为17．1％;以L5-8-2-1作亲本的F1为13．6％,B1F1为9．3％,结果表明：在不育系的转育过程中,以中低直链淀粉含量的转基因纯合株系为亲本,能有效降低F1和B1F1的种子直链淀粉含量。     

Production of waxy (amylose-free) wheats

The Waxy (Wx) protein has been identified as granule-bound starch synthase (GBSS; EC 24.1.21), which is involved in amylose synthesis in plants. Although common wheat (Triticum aestivum L.) has three Wx proteins, partial waxy mutants lacking one or two of the three proteins have been found. Using such partial waxy mutants, tetra- and hexaploid waxy mutants with endosperms that are stained red-brown by iodine were produced. Both mutants showed loss of Wx protein and amylose. This is the first demonstration of genetic modification of wheat starch.     

小麦Wx-B1基因酶切片段长度多态性及其与直链淀粉含量的关系

采用序列标志位点(sequence-tagged sites,STS)引物,对35个小麦品种的Wx-B1基因位点上的近第4个内含子区域的序列进行了扩增,用限制性内切酶BamHI切割.结果表明,扩增片段有的能被酶切,有的不能.酶切片段出现两种长度多态性,其长度与直链淀粉含量(AC)呈负相关.AC在约20%以上的小麦品种扩增的片段能够被BamHI切割,而在约20%以下的不能.以上结果表明,Wx-B1基因在扩增序列区域有多态性,这可以作为一种分子标记在育种中预测不同小麦品种的直链淀粉含量,以改良小麦品质.     

通过共转化和花药培养快速获得直链淀粉含量降低且无抗性标记的转基因水稻

用根癌农杆菌共转化的方法将p13W8质粒(含反义蜡质基因)和pCAMBIA1300质粒(含潮霉素抗性基因)导入水稻.经PCR检测,发现在29个T1群体中发生抗潮霉素抗性基因和反义蜡质基因的分离;从1 264个T1单株中筛选到183个只带反义蜡质基因片段的转基因植株.选择了4个直链淀粉含量降低的T1单株进行花药培养,获得正常结实的花培苗34株;经PCR检测,有23株为只含反义蜡质基因而无潮霉素抗性基因的植株.从转化到获得直链淀粉含量降低、遗传稳定的转基因植株仅用了一年半时间.     

Genetic analysis of waxy locus in rice (Oryza sativa L.)

Summary Inheritance of waxy locus was studied in crosses of a waxy variety with four non-waxy parents having high-, intermediate-, low- or very low-amylose content. The analysis for amylose content was done on a single grain basis in parents, F₁, F₂, B₁F₁, and B₂F₁ seeds. The waxy parent lacking synthesis of amylose content was found to differ from the ones having high-, intermediate-, low- or very low-amylose content by one gene with major effect. Dosage effects for amylose content were observed to have great influence on segregation pattern and efficiency of selection. Selection efficiency for amylose content can be enhanced by selecting for endosperm appearance in early segregating generations.     

Identification of three Wx proteins in wheat (Triticum aestivum L.)

Nullisomic analysis of waxy (Wx) protein of hexaploid wheat (Triticum aestivum L.) cv. “Chinese Spring” using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis revealed that threeWx loci,Wx-A1, Wx-B1, andWx-D1, located on chromosome arms 7AS, 4AL, and 7DS, produce three distinct Wx subunit groups, subunit group-A (SGA), SGB, and SGD, respectively. SGA has a higher molecular weight and a more basic isoelectric point (pI) than the other two. SGB and SGD have the same molecular weight but a slightly different pI range. Owing to the detection of these three subunit groups, we were able to identify the expression of three waxy genes in wheat endosperm and to find two types of mutants among Japanese wheat cultivars, one lacking SGA and the others SGB. These results suggest the possibility of breeding a waxy wheat.     

Differential effects of Wx-A1, -B1 and -D1 protein deficiencies on apparent amylose content and starch pasting properties in common wheat

Waxy (Wx) protein is a granule-bound starch synthase (GBSS) responsible for amylose production in cereal endosperm. Eight isolines of wheat (Triticum aestivum L.) having different combinations of presence and absence of three Wx proteins, Wx-A1, -B1, and -D1, were produced in order to elucidate the effect of Wx protein deficiencies on the apparent amylose content and starch-pasting properties. An improved SDS gel electrophoresis showed that ’Bai Huo’ (a parental wheat) carried a variant Wx-B1 protein from an allele, Wx-B1e. Thus, wheat lines of types 1, 2, 4, and 6 examined in this study contained a variant Wx-B1 allele and not the standard allele, Wx-B1a. The results from 3 years of experiments using 176 lines derived from two cross-combinations showed that apparent amylose content increased the least in type 8 (waxy) having no Wx proteins and, in ascending order, increased in type 5 (only the Wx-A1 protein is present) <type 7 (Wx-D1) <type 6 (Wx-B1) <type 3 (Wx-A1 and -D1) <type 4 (Wx-A1 and -B1) <type 2 (Wx-B1 and -D1) <type 1 (three Wx proteins). However, Tukey’ s studentized range test did not detect significant differences in some cases. Densitometric analysis suggested that the amylose content was related to the amount of the Wx protein in the eight types. Parameters in the Rapid Visco-Analyzer test and swelling power were correlated to amylose content. Consequently, amylose content and pasting properties of starch were determined to be influenced the most by the lack of the Wx-B1 protein, followed by a lack of Wx-D1, and leastly by the Wx-A1 deficiency, which indicated the presence of differential effects of the three null alleles for the Wx protein. Received: 1 February 1999 / Accepted: 10 April 1999     

水稻丽粳2号近等基因系杂种后代耐冷性遗传研究

在昆明低温冷害条件下,以十和田×(十和田和丽粳2号BC4F5)配制的杂种BC5F1、BC5F2、BC5F3和BC5F4及亲本为材料,用主基因-多基因混合遗传模型对丽粳2号作耐冷基因供体培育出的近等基因系进行孕穗期耐冷性遗传研究。结果表明:(1)杂种BC5F2、BC5F3和BC5F4分离群体在同一世代每穗实粒数与总粒数、结实率呈极显著的正相关;(2)以结实率为耐冷性鉴定指标,近等基因系孕穗期耐冷性受2对主基因和多基因共同控制,其主效基因的遗传率为90.97%,微效基因遗传率为3.83%,主基因和微效基因都存在加性-显性-上位性效应。