文心兰乙烯不敏感基因EIN2的克隆及表达分析

该研究采用PCR、RACE方法,对文心兰‘南茜’的乙烯不敏感蛋白基因（ethylene insensitive 2,EIN2）进行克隆及生物信息学分析,并采用qRT PCR技术,对该基因在文心兰不同组织器官和不同花期中的表达模式进行分析。结果表明：（1）成功克隆得到文心兰_EIN2基因序列,命名为OnEIN2（MH497388）;该基因cDNA序列全长为4 177 bp,其中开放阅读框3 879 bp,编码1 292个氨基酸,3′非编码区长208 bp,5′非编码区长90 bp。（2）生物信息学分析显示OnEIN2是一个不稳定的疏水蛋白,含有跨膜结构,分子式为C₆₄₀₆H₉₉₈₈N₁₆₇₀O₁₈₉₇S₄₇;蛋白质分子量142.22 kD,理论等电点5.80。多序列比对和系统进化分析表明,文心兰EIN2与铁皮石斛EIN2的相似度最高（81.98%）,二者亲缘关系也最为接近。（3）实时荧光定量PCR分析发现,OnEIN2基因在根、茎、叶花中均有表达,在花中表达量最高,茎中表达量最低;而在不同花期中,盛开期表达量最高,其次是衰老期。研究表明,文心兰OnEIN2基因在开花和衰老过程中可能有重要的作用。     

文心兰25条miRNA前体序列特性及其表达分析

为了解文心兰miRNA的序列特性及其在不同组织部位中以及软腐病侵染过程中的表达规律,该研究对文心兰转录组及miRNA数据库中的25条miRNA前体(pre miRNA)序列和15条成熟体序列进行序列特性分析,并对25条pre miRNAs在文心兰不同组织部位及软腐病侵染的假鳞茎中的表达情况进行实时荧光定量分析。结果显示：（1）文心兰25条pre miRNAs序列可分为13个家族,其中包含15条成熟体序列。（2）Mfold二级结构预测显示,文心兰25条pre miRNAs的最小折叠自由能在-32.04~ -120.98 kal/mol之间,均可以形成典型、稳定的发夹结构。（3）序列比对分析发现,同一家族的前体与成熟体存在一个约20个碱基长度的保守区域,推测该区域可能为文心兰miRNA成熟体所在区域。其中,13个前体家族中,有10个家族的成熟体可以完全定位于其前体中。（4）实时荧光定量PCR结果显示,在文心兰不同组织部位中,miR159 unigene0037857、miR167 unigene0011236、miR167 unigene0002619、miR169 unigene0022341、miR172 unigene006514、miR396 unigene19032、miR398 unigene0009996、miR2950 unigene0006151、miR2950 unigene0006422等pre miRNAs在叶片中大量累积可能有利于其叶的形态建成;miR162 unigene0003615、miR162 unigene0013441、miR166 unigene0011870、miR168 unigene0009958等pre miRNAs同时在根和叶中均大量表达有利于其根和叶的发育;而miR171 unigene0045985、miR396 unigene0011179、miR396 unigene0011180在根和茎中的大量表达可能有利于其根和茎的发育。（5）在软腐病病菌侵染文心兰假鳞茎的过程中,miR159 unigene0037857、miR167 unigene0011236、miR396 unigene0011179、miR396 unigene0011180、miR396 unigene0019032、miR845 unigene0012489的表达总体呈下降趋势;miR162 unigene0040566、miR166 unigene0011870、miR168 unigene0009958、miR171 unigene0045985在软腐病菌液侵染4 h其表达量升高,之后表达量下调;miR162 unigene0003615、miR167 unigene0002619、miR168 unigene0047942、miR169 unigene0022341、miR845 unigene0012489在菌液侵染过程中其表达量呈现先下降后上升的趋势,并在侵染8 h后表达量达到最低。研究表明,文心兰pre miRNAs 13个家族不同成员在进化进程中具有高度保守性与特异性的结构特点,并可能广泛参与文心兰不同组织的生长发育及参与软腐病菌侵染的响应。     

喷施不同生长调节剂对‘milliongolds’文心兰开花的影响

以文心兰‘milliongolds’品种分株苗为试验材料,研究不同种类和不同浓度的植物生长调节剂喷施对其开花的影响。结果表明:与不喷施生长调节剂(对照)相比,200 mg/L GA3和GA3(200 mg/L)+6-BA(25 mg/L)处理能使文心兰的花期显著提前;单一的6-BA处理使花朵变小,但花芽分化率提高;GA3+6-BA处理使花朵变大,花葶长度增加;喷施200 mg/L和250 mg/L PP333可使文心兰花期推迟,不同浓度PP333可以使花葶矮化;在假鳞茎形成期喷施生长调节剂对花梗第一间距粗度无显著影响。     

文心兰FT同源基因的克隆及其表达分析

FT(Flowering Locus T)及其同源基因被认为是植物开花、花发育相关的重要基因。为了深入研究FT同源基因的功能以及文心兰开花的分子机理,该研究以文心兰品种‘金辉’为试验材料,基于转录组测序结果,克隆获得‘金辉’FT同源基因,命名为OnFT(GenBank登录号为MK967676)。OnFT基因编码区长度为537 bp,共编码178个氨基酸;生物信息学分析表明,该蛋白质分子量约为19.99 kD,可能是一种亲水性不稳定蛋白质,属于PEBP家族蛋白;基于FT的系统进化分析表明,文心兰与同科植物桃红蝴蝶兰的亲缘关系较近。qRT-PCR分析结果显示,OnFT在文心兰不同组织的表达差异较大,在花中表达量最高,在根中几乎不表达;OnFT基因在幼嫩花芽中的表达量较低,并且在花的成熟过程中逐渐增加;OnFT基因在叶片和假鳞茎中的表达量随成熟度的增长均呈先上升后降低的变化趋势,在中苗期的叶片和抽芽期的假鳞茎中表达量较高。     

文心兰RNA不同提取方法比较

目的:为了得到高效的文心兰RNA提取方法和高质量的RNA,为后续文心兰分子生物学研究奠定基础.方法:选取文心兰“黄金2号”(Oncidium Gower Ramsey‘Gold2’)叶片和根组织为材料,对SDS-LiCl法、改良CTAB-NaAC法和改良CTAB-LiCl法和总RNA提取效果进行了比较研究.结果:改良CTAB-LiCl法得到的RNA样品纯度较高,完整性好,经电泳检测条带清晰无明显降解,28S条带的亮度是18S条带亮度的2倍,从叶片和气生根组织中提取RNA的OD260/OD280比值分别为1.797和1.787,提取率分别为33.07μg/g、29.07μg/g.以此RNA为模板进行RT-PCR反应,能获得特异条带.结论:改良CTAB-LiCl法是一种高效的文心兰RNA提取方法,所得样品RNA适合进一步的分子生物学研究.     

文心兰原球茎液体增殖培养研究

以茎尖诱导形成的原球茎(protocorm-like bodies,PLBs)为外殖体,采用液体培养方式比较了不同浓度的激素配比、蔗糖浓度和添加不同量的新鲜椰汁对文心兰PLBs增殖的影响,并比较了相同培养基成分时液体培养PLBs增殖、分化成苗和固体培养PLBs增殖和分化成苗的差异。试验结果表明:不同浓度的外源激素及其配比对文心兰PLBs增殖生长影响较大,6-BA0.5 mg/L Ad 0.05 mg/L NAA0.05 mg/L的激素组合比较适合文心兰PLBs增殖;蔗糖浓度对文心兰PLBs增殖的影响也较大,适合文心兰PLB在液体培养条件下增殖的蔗糖浓度为7.5 g/L;添加5%新鲜椰汁不仅对文心兰PLBs增殖有促进作用,而且能改善PLBs的质量;适合文心兰PLBs增殖的培养基为MS 6-BA0.5 mg/L Ad 0.05 mg/L NAA0.05 mg/L 5%椰汁 蔗糖7.5 g/L。文心兰PLBs在5周内的增殖生长曲线呈倒"V"字形,第3周的增殖速度达最高峰,而固体培养基PLBs增殖速度较慢,生长曲线几乎成直线。液体增殖的PLBs分化成苗较固体培养增殖的PLBs差。     

文心兰OnFNR基因的克隆及抗软腐病功能鉴定北大核心CSCD

为了解铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶(FNR)在文心兰抵御软腐病过程中的作用,该研究采用RACE技术从文心兰‘小樱桃’中克隆到一条OnFNR基因(登录号为KX461908),分析其序列特性和编码蛋白亚细胞定位情况,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析其在不同组织部位以及不同软腐病感病阶段的表达模式,构建OnFNR过表达载体并转化文心兰原球茎(PLBs),对转基因原球茎进行软腐病抗性评价。结果显示:(1)文心兰OnFNR基因开放阅读框长为1080 bp,预测可编码含359个氨基酸、分子量为40066.14 Da、等电点为8.72的碱性蛋白;OnFNR具有典型的FAD结合结构域和NADP+结合结构域,定位于叶绿体。(2)多序列比对和进化树分析发现,OnFNR与其他植物LFNR聚为一类,并与小兰屿蝴蝶兰LFNR的相似度最高(89.1%)。(3)qRT-PCR结果显示,OnFNR在文心兰叶中的表达量最高,其次是假鳞茎与花,根中最低;文心兰植株接种软腐病病原菌1 d后叶片和假鳞茎的OnFNR基因表达量呈现极显著下调,并且在5个感病阶段的表达量均低于健康植株。(4)成功构建过表达载体pCAMBIA1301-OnFNR,并经农杆菌EHA105侵染成功转入文心兰PLBs,获得过表达OnFNR转基因原球茎16个;在过表达OnFNR文心兰PLBs中,OnFNR与Fd基因表达均呈现极显著上调,尤其是Fd表达量上调至对照(非转基因PLBs)的3.67倍,且过表达OnFNR的PLBs在软腐病病原菌侵染第4天的存活率仍有48.88%,而对照的存活率只有6.66%。研究表明,文心兰OnFNR是一个定位于叶绿体的光合型铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶,过表达OnFNR能够明显提高文心兰植株的抗病性,推测OnFNR在植物抵抗病毒以及ROS爆发中具有重要作用,且过表达OnFNR可能通过提高LET的电子传递效率,进而提高Fd的表达量达到促进MAPK通路信号传导的效果。     

文心兰原球茎形态发生与可溶性物质及抗氧化酶的关系

以文心兰切花品种'南茜'无菌苗为材料,取其茎尖通过组织培养诱导形成原球茎和幼苗,观察并分析了原球茎各形态发生阶段的特征及其可溶性糖和蛋白质含量、抗氧化酶(POD、CAT和SOD)活性以及相关同功酶(POD、EST和SOD)的变化.结果显示:(1)文心兰原球茎形态发生可分为外植体期、外植体膨大期、愈伤组织期、原球茎形成期、原球茎成熟期、叶鞘伸展期、顶端腋芽发育期及幼苗期8个阶段.(2)可溶性糖和蛋白质含量均在叶鞘伸展期出现最大峰值;POD活性在外植体膨大期、CAT和SOD活性在愈伤组织期分别出现最大峰值.SOD同工酶的2条酶带在愈伤组织期到幼苗期交替出现;EST同工酶在原球茎形成期有2条特异酶带.研究表明,可溶性糖和蛋白质的含量以及POD、CAT、SOD活性的特异变化与文心兰茎尖脱分化及原球茎再分化的实现密切相关,不同类型的同工酶在原球茎同一发生阶段表现出较大差异,EST同工酶的2条特异酶带可作为原球茎形成的标志.     

不同添加物对文心兰原球茎增殖及试管苗生长的影响

以文心兰切花品种‘南茜’原球茎（PLB）及试管苗为材料,在培养基MS＋6-BA2mg／L＋Ad1mg／L＋NAA0．1mg／L＋蔗糖30g／L基础上,利用增殖系数及不同形态指标加权分析研究马铃薯、芋头、南瓜、香蕉及活性炭（AC）5种培养基添加物及其组合对‘南茜’PLB增殖及试管苗生长的影响。结果表明,适宜文心兰PLB增殖培养的添加物为马铃薯泥50g／L,培养45d后,PLB增殖系数是对照的3．64倍;适宜无菌小苗（约1．5cm）增殖及生长的添加物为香蕉泥50g／L＋AC1g／I,,加权总分是对照的1．53倍;适宜无菌中苗（约2．5cm）增殖及生长的添加物为马铃薯泥25g／L＋香蕉泥25g／L,加权总分是对照的1．55倍。     

琼脂浓度、pH值及接种苗大小对文心兰试管苗增殖的影响

探讨了培养基中琼脂浓度、pH值和接种苗大小对文心兰试管苗增殖及生长发育的影响。结果表明：培养基中使用的琼脂浓度不仅对文心兰试管苗的增殖有影响,而且对试管苗后期的生长发育也有影响,在琼脂粉使用量达6．0g/L时,增殖率明显降低,后期苗生长发育不良;接种苗的大小对试管苗的增殖率影响较大,小苗易于形成丛生芽苗和原球茎,增殖系数可达7．07,而大苗则不能形成丛生芽苗也无原球茎形成;培养基的pH值在5,2～6．5范围内,试管苗增殖率差异不明显,试管苗的生长发育均正常。