大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化与初步鉴定

目的：探讨体外分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的方法,分析其部分表型特点。方法：用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs,传代扩增,测定生长曲线,形态学观察,免疫细胞化学及图像分析测定细胞表面抗原和细胞外基质蛋白表达情况。结果：MSCs属骨髓中单个核细胞,密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓MSCs,MSCs在含10％小牛血清的L-DMEM中生长性状相对稳定,1、3、5代细胞生长曲线基本一致,增殖速度快。细胞呈均一的成纤维细胞样,均一表达CD44、CD54、纤维粘连蛋白(Fibronectin,FN)、Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)。结论：本实验建立了一种体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓MSCs的方法,MSCs稳定表达CD44、CD54、FN、CollagenⅠ。     

HLA-G参与骨髓间充质干细胞的抑制作用机制探讨

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（MSC）在活体肾移植供受者间的混合淋巴细胞培养（MLR）中的作用机制,证明人白细胞抗原（HLA）-Ⅰ类分子HLA-G参与了MSC的免疫调节作用。方法：从人骨髓中分离培养MSC,采用形态学观察及流式细胞术分析鉴定后,加入活体肾移植供受者间的MLR,观察MSC的HLA-G表达及对T细胞增殖的影响,淋巴细胞增殖实验采用MTT法。结果：MSC细胞表面和胞浆内均表达HLA-G,流式细胞术分析细胞表面HLA-G平均表达率为37.3%,胞浆内HLA-G平均表达率为65.1%,ELISA法检测细胞培养上清中可溶性HLA-G含量为18.9ng/mL。将MSC和培养上清液加入活体肾移植供受者间的MLR体系中,均使得T细胞抑制率增高;而加入HLA-G特异性抗体,MSC的抑制率降低。结论：MSC表面和胞浆内均有HLA-G表达,在其培养上清中检测到由MSC分泌的可溶性HLA-G5;MSC表达和分泌的HLA-G是其发挥抑制功能的关键因素之一。为MSC在预防器官移植术后排斥反应的临床应用提供了理论依据。     

骨髓间充质干细胞在大鼠实验中的移植途径及比较

骨髓间充质干细胞是具有自我更新能力和分化潜能的一类成体干细胞,经过局部微环境的诱导,可在体内外进行扩展,到晚期可分化成为多种细胞系。当组织受损伤时,可迅速到达损伤部位,分化为特异的组织细胞,参与组织修复。骨髓间充质干细胞这种惊人的分化及组织修复能力,为治疗退行性疾病和器官损伤性疾病提供广阔前景,故成为科研热点。国内外相关实验研究多以大鼠为动物模型,而骨髓间充质干细胞如何进入大鼠体内并定植,是实验成功的重要前提。因此如何找到最合适、最安全的移植途径将骨髓间充质干细胞有效地移植进入大鼠疾病模型体内的受损区域,是研究者关心的重点。本文就目前骨髓间充质干细胞在大鼠实验中不同移植途径进行综述,并比较各种途径的优缺点,希望能对临床科研工作提供参考,并期待能有更成熟的移植手段来推动骨髓间充质干细胞实验研究的进展。     

骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠肝损伤的实验研究

目的:了解肝损伤大鼠在输注骨髓间充质干细胞后肝功能生化指标和肝脏组织病理变化情况,为临床应用提供实验依据。方法:将大鼠随机分为正常组和造模组。造模组采用腹腔注射四氯化碳的方法构建,然后将造模组随机分为干细胞移植治疗组、模型对照组。干细胞移植组经门静脉输注标记的骨髓间充质干细胞。3周后处死大鼠。然后检测大鼠肝功能、肝脏病理改变分析干细胞移植治疗肝损伤效果。结果:干细胞移植治疗3周后,大鼠的肝脏与对照组比较,明显恢复,但是并没有恢复到正常水平。结论:骨髓间充质干细胞对肝损伤的大鼠有治疗作用。     

人骨髓间充质干细胞在成年大鼠脑内的迁移及分化

骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSCs)是目前备受关注的一类具有多向分化潜能的组织干细胞 ,体外可以分化为骨、软骨、脂肪等多种细胞。因此 ,MSCs是细胞治疗和基因治疗的种子细胞之一。为了探索MSCs的迁移和分化趋势 ,为帕金森病 (Parkinsondisease,PD)的干细胞治疗提供理论和实验依据 ,本实验将体外扩增并转染增强型绿色荧光蛋白 (enhancedgreenfluorescentprotein ,EGFP)的人骨髓MSCs注入PD大鼠脑内纹状体 ,观察了人骨髓MSCs在大鼠脑内的存活、迁移、分化以及注射MSCs前后大鼠的行为变化。结果表明 ,人骨髓MSCs在大鼠脑内可存活较长时间 ( 10周以上 ) ;随着时间的延长 ,MSCs迁移范围扩大 ,分布于纹状体、胼胝体、皮质以及脑内血管壁 ;免疫组化法检测证实MSCs在大鼠脑内表达人神经丝蛋白 (neurofilament,NF)、神经元特异性烯醇化酶 (neuron specificeno lase,NSE)以及胶质原纤维酸性蛋白 ( glialfibrillaryacidprotein ,GFAP) ;PD大鼠的异常行为有所缓解 ,转圈数由 8 86±2 0 9r/min下降到 4 87± 2 0 6r/min ,统计学分析P <0 0 5为差异显著。以上观察结果表明 ,骨髓MSCs有望成为治疗PD的种子细胞     

人VEGF基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

为建立hVEGF165基因转染大鼠间充质干细胞的方法．采用密度梯度离心-贴壁培养法获Wistar大鼠BMMSC,并测定其生长曲线和表面标志CD34、CD44、CD45及SH3,然后向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化;用脂质体介导pcDNA3.1-hVEGF165转染BMMSC,观察转染后细胞形态和生长情况的变化,通过RT-PCR、Western和ELISA鉴定VEGF在细胞中的表达情况．经培养的大鼠BMMSC,CD44、SH3检测为阳性．CD45、CD34阴性,可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞;经RT-PCR、Western和ELISA检测证实阳离子脂质体能成功地将hVEGF165基因转染至大鼠BMMSC中,并获得有效的表达．真核表达栽体pcDNA3.1-hVEGF165在BMMSC中获有效表达,为VEGF基因转染BMMSC移植对心梗后大鼠心功能及心室重构的影响提供了实验依据．     

骨髓间充质干细胞体内诱导分化为心肌细胞

观察骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)植入体内后,在心肌微环境诱导下分化为心肌细胞的能力。无菌条件下取出大鼠双侧股骨及胫骨,冲洗骨髓腔获得细胞,贴壁筛选法纯化MSCs,体外培养、扩增,4,6-二咪基-4-联苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)标记细胞,注入结扎冠脉左前降支所致心肌梗塞模型鼠的心肌组织。在不同时间点处死大鼠,获取心肌组织,采用HE染色和电镜技术对植入MSCs进行形态学观察和超微结构检测,荧光免疫组化检测植入MSCs肌球蛋白重链(MHC)和心肌特异性抗原Cx43的表达,同时应用RT-PCR技术检测心脏早期发育基因NKx2．5、GATA-4的表达。结果发现细胞标记效率为100％,通过连续检测MSCs植入后细胞形态从无规则状态、幼稚细胞表型逐渐向成熟心肌细胞方向转化,植入细胞排列同正常肌纤维方向平行,且植入四周后电镜检测到闰盘的存在;两周出现MHC的表达,后随时间延长表达逐渐增强。四周出现Cx43的表达,以后表达稳定,RT-PCR检测NKx2．5、GATA-4在一天即出现弱表达,两周～三周时表达最强,以后强度逐渐减弱。结果表明MSCs在体内微环境条件下能够转化为心肌细胞。     

骨髓间充质干细胞的研究进展

骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞群体 ,具有支持造血、多向分化潜能以及在细胞和基因工程中具有潜在应用前景等特点 ,将在医学上具有重要的临床应用价值。     

骨髓间充质干细胞源神经细胞移植治疗帕金森病大鼠模型

目的探讨骨髓间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSCs）源神经细胞脑内移植对帕金森病（Parkinson s disease,PD）大鼠的治疗作用。方法贴壁培养法分离、培养大鼠骨髓MSCs,脑匀浆上清诱导第3代MSCs向神经细胞分化,采用免疫细胞化学法鉴定诱导分化后细胞的性质,激光共聚焦显微镜检测诱导前后细胞Ca2＋浓度变化,6只PD大鼠行纹状体内MSCs源神经细胞移植作为细胞移植组,6只PD大鼠作为对照组。细胞移植术后4周检测PD大鼠的行为变化,观察移植细胞在脑内的分布情况。结果倒置显微镜下可见MSCs呈纺锤形和多角形,有1～2个核仁,MSCs经脑匀浆上清诱导后其胞体折光性增强,发出数个细长突起,互相交织成网,有的似轴突。诱导后细胞表达神经元特异性标志物神经元特异性烯醇化酶（NSE）和神经丝蛋白（NF）,胞质Ca2＋荧光强度显著增强,可推测诱导后的细胞为MSCs源神经细胞,将BrdU标记的MSCs源神经细胞移植到PD大鼠纹状体治疗4周后,可见细胞散在分布于注射侧脑组织,有少量细胞可迁移到对侧脑组织,PD大鼠的旋转行为得到显著改善。结论MSCs源神经细胞移植治疗帕金森病大鼠可使其旋转行为得到改善。     

骨髓间充质干细胞可塑性研究

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs）具有跨系统、甚至跨胚层分化的特性,称为MSCs的可塑性（plasticity）,成为细胞工程、再生医学中的主要选择细胞。但随着对成体干细胞可塑性质疑的出现,使MSCs是否具有转分化能力,存在着极大的分歧。对MSCs可塑性是否真正存在的进一步明确,越加显得急切和重要,也对干细胞基础理论及其临床应用具有指导性意义。     

同种异体大鼠骨髓间充质干细胞移植对放射性空肠损伤的修复作用

目的观察同种异体骨髓间充质干细胞（MSCs）移植对放射性空肠的修复作用。方法全骨髓贴壁体外培养大鼠MSCs并进行DAPI标记。对大鼠行5 Gy X线全腹部照射,每隔72 h照射1次,共5次,制备放射性空肠损伤动物模型。取40只大鼠,随机分成正常对照组、模型及MSCs治疗组及DAP标记组。激光共聚焦显微镜下观察DAPI标记的MSCs在空肠组织中富集情况。病理学观察MSCs对放射性空肠损伤的修复作用。结果正常大鼠空肠黏膜结构清楚,隐窝深遂,腺体丰富,模型组7 d黏膜上皮细胞坏死脱落,隐窝几乎完全破坏,治疗组7 d黏膜坏死组织较少,黏膜增厚,30 d治疗组核分裂相增加,较模型组增加明显。结论成功建立放射性空肠损伤动物模型,MSCs可以促进空肠再生与修复。     

乙酰水杨酸预处理骨髓间充质干细胞对实验性牙周炎大鼠的治疗作用

本研究旨在探讨应用乙酰水杨酸(ASA)预处理的骨髓间充质干细胞(BMMSCs)治疗对大鼠牙周炎模型中的牙周骨修复的影响。通过建立大鼠牙周炎动物模型并使用ASA和BMMSCs联和治疗大鼠,本研究检测了体外BMMSCs的成骨分化、成脂分化、碱性磷酸酶(ALP)活性及成骨相关基因(ALP和OCN)的表达,并检测大鼠相关炎症因子(TNF-α,IL-17和IL-10)水平。结果显示,使用成骨培养基诱导BMMSCs后,可清晰地观察到BMMSCs的成骨分化和成脂分化。体外研究显示,60μg/mL的ASA显著促进了体外BMMSCs的增殖,提高了碱性磷酸酶(ALP)活性,促进了钙沉积和上调了成骨相关基因(ALP和OCN)的表达。此外,与未治疗的牙周炎大鼠比较,经ASA-BMMSCs治疗的牙周炎大鼠的TNF-α和IL-17水平显著下降,而IL-10显著升高。本研究表明,60μg/mL的ASA显著促进了体外BMMSCs的增殖和成骨分化。ASA和BMMSCs联用能够调节大鼠体内相关细胞因子的表达,并减轻炎症反应,可能是牙周炎治疗和牙周骨再生的有效方法。     

鼠疫F1抗原和V抗原双组分候选疫苗的免疫学评价

目的通过由提取的鼠疫F1抗原和重组鼠疫V(rV)抗原组成的鼠疫候选疫苗免疫豚鼠,对其免疫效果进行评价。方法将豚鼠随机分成5个试验组,在免疫后不同时间点采血进行抗体检测、MTT法淋巴细胞增殖试验以及皮肤迟发型超敏反应(DTH)检测。结果抗体检测结果显示,双组分鼠疫候选疫苗能诱导较强的体液免疫应答;MTT细胞增殖结果显示,脾脏淋巴细胞特异性增殖不明显;中剂量组、高剂量组针对F1和rV抗原DTH阳转率均为100%。结论双组分鼠疫候选疫苗能诱导豚鼠体液免疫和细胞免疫应答,该疫苗有希望成为我国新一代鼠疫疫苗。     

骨髓间充质干细胞在脱细胞真皮基质再生过程中的初步研究

较大的腹壁缺损需要应用补片修复来缓解腹横筋膜的张力,人工合成补片的应用一定程度上实现了无张力修补的目的,但它在腹壁外科应用中有诸多的并发症,诸如复发率高,腹腔黏连,肠穿孔导致腹膜炎,侵袭性肠瘘等影响患者术后的正常生活,而脱细胞真皮基质(Acellular dermal matrix,ADM)作为一种新型的生物材料应用在腹壁外科中能解决上述人工合成补片所带来的并发症发挥强大作用且能与周围组织较好的融合,最后改建成宿主自身组织已并在多学科领域中广泛应用;骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)能参与组织自我修复,并能分化成为多种功能细胞,分泌各种生长因子,在ADM内源性转归过程中可发挥作用。本文就对骨髓间充质干细胞在ADM生物补片应用于临床疝修补术中转归机制的研究做一综述。     

影响骨髓间质干细胞向成骨细胞分化的调控因素

长期的骨骼废用引起的骨质减少主要归因于骨形成的减少,成骨细胞由具有多向分化潜能的间充质细胞经骨原细胞、前成骨细胞分化而来,骨髓间质干细胞是骨髓来源的具有多向分化潜能的干细胞,本文综述了骨髓间质干细胞向成骨细胞分化的调控因素,有助于增加对骨丢失的理解,并进行预防和治疗,为航天员和骨骼废用病人创造更健康的生活。     

表皮生长因子诱导骨髓间充质干细胞向视网膜神经细胞分化的体外研究

目的:研究表皮生长因子诱导骨髓间充质干细胞向视网膜神经细胞分化的可能性。方法:体外培养骨髓间充质干细胞,利用流式细胞仪分析其细胞表型。采用含EGF的培养液诱导骨髓间充质干细胞向视网膜神经细胞分化,并利用免疫荧光法进行鉴定。结果:从骨髓中分离培养的细胞具有成纤维细胞样形态,贴壁生长,表型相对均一,表面标志为CD90、CD44、CD147阳性;而CD34、CD38、CD45、CD14、HLA-DR阴性。体外诱导后可以得到神经干细胞标志物nestin、神经胶质细胞标志物GFAP和视网膜光感受器细胞标志物Rhodopsin呈阳性表达的细胞。结论:从骨髓中分离培养得到的间充质干细胞具有向视网膜神经细胞分化的潜能。     

骨形态发生蛋白诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的研究进展

目前从骨髓中成功分离、鉴定BMSCs的方法较为成熟。新发现一些物质能诱导BMSCs向成骨细胞分化因子,其中对BMP研究较多。其机制可能是通过结合Ⅰ、Ⅱ型BMP受体后激活Smad信号通路诱导成骨。其诱导方法主要包括直接应用天然BMP或者将BMP及其协同基因转入BMSCs,通过靶细胞的持续表达BMP促进新骨形成。本文将近10年BMP诱导BMSCs向成骨分化的研究现状及发展趋势做一综述。     

骨髓间充质干细胞移植对脑梗死大鼠神经功能恢复的影响

目的:观察骨髓间充质干细胞(BMSC)移植对脑梗死大鼠神经功能恢复的影响,并对其相关机制进行探讨。方法:90只大鼠随机分为3组:假手术组、对照组、BMSC移植组,每组30只。对照组和BMSC移植组建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型,假手术组只需要分离大鼠颈部组织,而不造MCAO模型。BMSC移植组在MCAO模型术后1天经尾静脉注射1 mL/3×10~6 BMSC,对照组注射同剂量的生理盐水,于MCAO术后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d分别对各组大鼠进行神经功能评分(mNSS),术后2个月对BMSC移植组及对照组大鼠脑组织进行免疫组化染色,检测MAP2、TUJ1、Ⅷ因子、GFAP的表达情况。结果:在治疗后的第7天至第35天,BMSC移植组mNSS均显著低于对照组(P0.05)。术后2个月,BMSC移植组MAP2、TUJ1、Ⅷ因子表达量显著高于对照组,而GFAP表达量显著低于于BMSC对照组(P0.01)。结论:BMSC移植可以促进脑梗死神经功能的恢复。