GST pull-down验证流感病毒PB1-F2蛋白与热休克蛋白40的相互作用

为体外验证流感病毒PB1-F2与热休克蛋白Hsp40相互作用,通过两个方向的GST pull-down试验验证PB1-F2与Hsp40的相互作用。构建GST-多肽融合蛋白原核表达载体pGEX-6P-1-PB1-F2和pGEX-6P-1-Hsp40,并在大肠杆菌(E.co-li)BL21中诱导表达;构建真核表达载体pLEGFP-Hsp40及pCAGGS-PB1-F2,并分别转染293T细胞使其表达Hsp40及PB1-F2融合蛋白,然后进行GST pull-down试验验证二者的相互作用。成功地构建了两种蛋白的各种表达载体,经表达、纯化获得了可溶性的GST-多肽融合蛋白,GST pull-down试验正反两方向都证实了PB1-F2与Hsp40的相互作用,初步证实了流感病毒PB1-F2在体外能与Hsp40发生相互作用。     

GST pull-down联合质谱技术鉴定与calponin-3相互作用的蛋白质

人(Homo sapiens)源calponin-3蛋白由CNN3基因编码,是一种与应激纤维相关肌动蛋白结合的蛋白质。研究表明其参与伤口愈合、细胞收缩、生物发育、细胞融合以及癌细胞侵袭转移等生物过程。鉴于calponin-3生物学功能的多样性,了解其在细胞中的相互作用信息,将有助于深入探讨其执行生物功能的分子机制。本研究通过构建人源calponin-3的重组原核表达质粒pGEX-4T-CNN3,优化重组蛋白的原核表达诱导条件,获得GST-calponin-3融合蛋白。并通过GST pull-down实验“垂钓”人胚肾上皮细胞293t中直接或间接与calponin-3结合的靶蛋白。经由LC-MS/MS质谱分析,共鉴定到11个潜在的与calponin-3相互作用靶蛋白。进而对这些蛋白质进行GO(gene ontology)功能分析,发现其主要参与细胞黏附、催化活性、结构分子活性和翻译调控等生物过程。其中,靶蛋白Actin参与了阿尔茨海默病、钙黏着蛋白信号通路、Rho GTPase调节细胞骨架、亨廷顿病、趋化因子和细胞因子信号转导途径介导炎症以及Wnt信号通路等。这些结果表明calponin...     

GST pull-down结合质谱筛选猪圆环病毒2型ORF4潜在互作蛋白

猪圆环病毒2型编码的ORF4蛋白是近年来发现的新蛋白。迄今为止,人们对ORF4所参与的细胞生物学过程知之甚少。本研究首先构建了带双标签的真核表达载体pCMV-N-Flag-GST,再将ORF4基因插入该载体中,形成pCMV-N-Flag-GST-ORF4。将质粒转染293T细胞表达ORF4后,通过GSTPull-down试验捕获细胞内潜在与ORF4互作的蛋白库。经SDS-PAGE分离及银染后,对所得的特异性条带进行质谱鉴定,筛选出5个与ORF4潜在互作的蛋白,包括丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶6催化亚基、α心肌蛋白、β肌动蛋白、SEC-14样蛋白5和肌球蛋白myosin 9。上述研究结果为深入揭示ORF4在病毒感染细胞过程中发挥的作用提供新的思路与方向。     

GST pull-down筛选冠突曲霉MAT的互作蛋白*

目的: 冠突曲霉(Aspergillus cristatus)是一种同宗结合菌,它的产孢受渗透压调控,与构巢曲霉的光调控产孢机制存在较大差异。冠突曲霉的有性生殖主要受MAT1-1-1和MAT1-2-1调控,但MAT基因对该菌有性生殖的调控机制仍不清楚。期望筛选得到冠突曲霉MAT的互作蛋白,为深入研究冠突曲霉有性产孢机制奠定基础。方法: 利用GST pull-down联合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术筛选可能与冠突曲霉MAT1-1-1和MAT1-2-1互作的蛋白,结合ProteinPilot和冠突曲霉基因组注释结果进行互作蛋白的注释及GO分析,其中互作蛋白SI65_00917和SI65_03348利用RT-qPCR探索它们与有性发育的联系,并利用酵母双杂交技术初步验证它们与MAT蛋白的互作关系。结果: 成功构建了GST-MAT1-1-1、GST-MAT1-2-1表达载体,诱导表达纯化出目的诱饵蛋白,分别利用诱饵蛋白捕获冠突曲霉总蛋白中的互作蛋白,经分析、筛选共鉴定出与MAT1-1-1互作的蛋白56个,与MAT1-2-1互作的蛋白413个。GO分析表明,这些蛋白参与翻译调控、代谢过程、蛋白质转运及蛋白结合等生物学过程,具有核苷酸结合活性、催化活性、蛋白结合活性;RT-qPCR结果表明互作蛋白SI65_00917可能与有性发育相关。酵母双杂交结果表明,SI65_00917蛋白具有自激活作用,可能是转录因子;SI65_03348蛋白与MAT1-1-1、MAT1-2-1在酵母中均有互作。结论: MAT通过与其他蛋白直接或间接的相互作用调控其有性发育过程。     

IRSp5 3和MIM同源结构域IMD相互作用蛋白质的鉴定

IRSp53(胰岛素受体酪氨酸激酶底物)和MIM(肿瘤转移消失蛋白)的同源结构域(IMD结构域)在IR-Sp53/MIM家族调控肌动蛋白动态变化的过程中起重要作用.IMD结构域具有使肌动蛋白纤维成束的活性,与小分子GTPase家族Racl也存在相互作用.然而,IMD结构域是否存在其它相互作用蛋白并不清楚.本研究利用GST pull down技术结合质谱分析从大鼠小脑中筛选IMD结构域的相互作用蛋白,得到了几个候选蛋白.其中,神经发育中下调蛋白NEDD9与IRSp53及MIM在小脑中存在类似的分布,体外实验进一步证明了两者之间的相互作用,暗示NEDD9是一种新的IMD结构域相互作用蛋白质.     

GST pull-down联合质谱筛选(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在小鼠睾丸组织中的相互作用蛋白质北大核心CSCD

(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1(dystrobrevin binding protein 1,dysbindin-1)是溶酶体相关细胞器生物发生复合体-1(biogenesis of lysosome-related organelles complex 1,BLOC-1)的1个亚基,在多种组织细胞中广泛表达;然而,其在睾丸组织中的作用至今尚不明确。为寻找(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质,以进一步研究(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸中的作用,本研究首先在Rosetta(DE3)菌种中表达可溶性GST-dysbindin-1融合蛋白,经谷胱甘肽-琼脂糖珠亲和纯化后,与小鼠的睾丸组织蛋白质孵育进行GST pull-down实验,并通过液相色谱串联质谱(LC MS/MS)分析筛选(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质。利用Bio GPS数据库聚类在睾丸组织中高表达和特异性表达的互作蛋白质,运用DAVID6.8在线分析工具从细胞组分、分子功能、生物学过程和KEGG通路等方面对筛选出的互作蛋白质进行GO(gene ontology)富集分析。本实验共筛选出108个(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的潜在互作蛋白质,其中98个为尚未报道的(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1相互作用蛋白质,7个为睾丸高表达蛋白质,5个为睾丸特异性表达的蛋白质。这些候选蛋白质主要分布在细胞质、细胞核、细胞膜、细胞外泌体等细胞组分中,通过与蛋白质、核酸等分子结合参与蛋白质翻译和转运、囊泡运输及凋亡等生物学过程以及氨基酸生物合成、溶酶体及蛋白酶体等生物学通路。我们推测,在睾丸组织中(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1可能通过与多种蛋白质相互作用参与精子的发生和受精等过程。     

GST pull-down联合质谱筛选（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在小鼠睾丸组织中的相互作用蛋白质

（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1（dystrobrevin binding protein 1,dysbindin-1）是溶酶体相关细胞器生物发生复合体-1(biogenesis of lysosome related organelles complex 1, BLOC-1)的1个亚基,在多种组织细胞中广泛表达;然而,其在睾丸组织中的作用至今尚不明确。为寻找（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质,以进一步研究（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸中的作用,本研究首先在Rosetta(DE3)菌种中表达可溶性GST-dysbindin-1融合蛋白,经谷胱甘肽 琼脂糖珠亲和纯化后,与小鼠的睾丸组织蛋白质孵育进行GST pull-down实验,并通过液相色谱串联质谱（LC MS/MS）分析筛选（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质。利用BioGPS数据库聚类在睾丸组织中高表达和特异性表达的互作蛋白质,运用DAVID6.8在线分析工具从细胞组分、分子功能、生物学过程和KEGG通路等方面对筛选出的互作蛋白质进行GO（gene ontology）富集分析。本实验共筛选出108个（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的潜在互作蛋白质,其中98个为尚未报道的（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1相互作用蛋白质,7个为睾丸高表达蛋白质,5个为睾丸特异性表达的蛋白质。这些候选蛋白质主要分布在细胞质、细胞核、细胞膜、细胞外泌体等细胞组分中,通过与蛋白质、核酸等分子结合参与蛋白质翻译和转运、囊泡运输及凋亡等生物学过程以及氨基酸生物合成、溶酶体及蛋白酶体等生物学通路。我们推测,在睾丸组织中（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1可能通过与多种蛋白质相互作用参与精子的发生和受精等过程。     

结构域相互作用数据库的产生、发展与应用

结构域是进化上的保守序列单元,是蛋白质的结构和功能的标准组件．典型的两个蛋白质间的相互作用涉及特殊结构域间的结合,而且识别相互作用结构域对于在结构域水平上彻底理解蛋白质的功能与进化、构建蛋白质相互作用网络、分析生物学通路等十分重要．目前,依赖于对实验数据的进一步挖掘和对各种不同输入数据的计算预测,已识别出了一些相互作用/功能连锁结构域对,并由此构建了内容丰富、日益更新的结构域相互作用数据库．综述了产生结构域相互作用的8种计算预测方法．介绍了5个结构域相互作用公共数据库3DID、iPfam、InterDom、DIMA和DOMINE的有关信息和最新动态．实例概述了结构域相互作用在蛋白质相互作用计算预测、可信度评估,蛋白质结构域注释,以及在生物学通路分析中的应用．     

不同未知功能结构域蛋白家族(DUFs)基因在植物中的生物学功能

未知功能结构域蛋白家族(domains of unknown function protein families,DUFs)是一大群并未表征功能的蛋白家族,其蛋白结构中包含至少一个高度保守的DUF结构域。在众多的DUFs蛋白家族中存在一些植物特有的DUFs蛋白家族,其参与调控植物生长发育、植物对病虫害的防御反应和植物对非生物胁迫的应答反应等生物学过程。本文对近几年关于植物DUFs基因参与上述生物学功能方面的研究进行了综述,旨在为未知功能基因的挖掘及其调控机制的阐明提供基础资料。     

GYF结构域蛋白特性及其生物学功能研究进展

甘氨酸-络氨酸-苯丙氨酸(glycine-tyrosine-phenylalanine,GYF)结构域是一种小型的、能识别富脯氨酸序列(proline rich sequences,PRS)的保守、多功能接合结构域,GYF结构域蛋白在蛋白蛋白相互作用、翻译起始、mRNA剪接、监管与翻译抑制、泛素连接、信号转导、免疫蛋白酶调控等方面起重要作用。本文从结构域特性、与靶蛋白的相互作用及其功能等方面综述GYF结构域蛋白的研究进展。     

利用IMAC与LC-MS/MS技术分离和鉴定化脓链球菌中的锌结合蛋白

化脓链球菌是一种革兰氏阳性致病菌,能引起一系列疾病。运用固定化金属离子亲和层析技术(IMAC)富集化脓链球菌中锌结合蛋白,进行溶液酶解,利用先进的LC-MS/MS技术对富集的锌结合蛋白进行质谱分析。鉴定到48个在化脓链球菌中与锌结合相关蛋白,这些蛋白主要涉及到蛋白翻译、糖代谢、金属转运、氧化等重要生理过程。这些结果对于深入研究化脓链球菌的致病机制,寻找新的抗菌药物作用靶点和疫苗候选物具有重要意义。     

Profiling Eph receptor expression in cells and tissues

Addendum to: Diarra D, Stolina M, Polzer K, Zwerina J, Ominsky MS, Dwyer D, Korb A, Smolen J, Hoffmann M, Scheinecker C, van der Heijde D, Landewe R, Lacey D, Richards WG and Schett G. Dickkopf-1 Is a Master Regulator of Joint Remodeling. Nat Med. 2007; 13:156-63. Remodeling of joints is a key feature of inflammatory and degenerative joint disease. Bone erosion, cartilage degeneration and growth of bony spurs termed osteophytes are key features of structural joint pathology in the course of arthritis, which lead to impairment of joint function. Understanding their molecular mechanisms is essential to tailor targeted therapeutic approaches to protect joint architecture from inflammatory and mechanical stress. This addendum summarizes the new insights in the molecular regulation of bone formation in the joint and its relation to bone resorption. It describes how inflammatory cytokines impair bone formation and block the repair response of joints towards inflammatory stimuli. It particularly points out the key role of Dickkopf-1 protein, a regulator of the Wingless signaling and inhibitor of bone formation. This new link between inflammation and bone formation is also crucial for explaining the generation of osteophytes, bony spurs along joints, which are characterized by new bone and cartilage formation. This mechanism is largely dependent on an activation of wingless protein signaling and can lead to complete joint fusion. This addendum summarized the current concepts of joint remodeling in the limelight of these new findings.     

人干细胞转录因子Nanog和BTB/POZ家族蛋白NAC1的相互作用

目的：研究人干细胞转录因子Nanog和BTB/POZ家族蛋白NAC1的相互作用,并初步确定作用区域。方法：应用免疫共沉淀、GSTpull-down实验验证人Nanog与NAC1的相互作用。结果：人Nanog与NAC1能够相互作用,且NAC1的BTB/POZ结构域对于二者相互作用是必需的。结论：人Nanog和NAC1在体内、外均能形成复合物,二者的相互作用对于人胚胎干细胞的自我更新及肿瘤的发生可能具有重要的作用。     

利用酵母双杂交技术筛选与hPOT1相互作用的新蛋白

目的:利用酵母双杂交系统筛选与人POT1(human protection of telomeres 1,hPOT1)相互作用的蛋白。方法:以hPOT1的300～634氨基酸片段为诱饵,在人乳腺cDNA文库中筛选能与hPOT1相互作用的蛋白质;运用营养缺陷型培养基和X-α-Gal实验排除假阳性,并对阳性克隆进行序列测定和比对。结果:经过酵母双杂交筛选,发现7个与hPOT1相互作用的蛋白;选取NM23B与hPOT1通过GST-pull down和免疫共沉淀进行进一步的验证,结果证明它们确实存在相互作用。结论:hPOT1能与NM23B发生相互作用,在此实验基础上可以进一步研究NM23B与hPOT1相互作用的生物学意义。     

酵母双杂交筛选人乳腺cDNA文库中与Gankyrin相互作用的蛋白

目的：应用酵母双杂交技术,筛选与Gankyrin有相互作用的蛋白质。方法：应用酵母双杂交系统,以Gankyrin基因全长为诱饵,在人乳腺cDNA文库中筛选能与Gankyrin相互作用的蛋白质,并运用营养缺陷型培养基和X-α-Gal等实验提供的信息,筛除假阳性克隆。结果：以Gankyrin为诱饵筛选出了5个阳性克隆,对其中一个蛋白质RhoGDI2与Gankyrin进行了免疫共沉淀与GSTpull-down实验验证,证实了它们的相互作用。结论：Gankyrin能与RhoGDI2发生相互作用,在此基础上,可以开展Gankyrin调控肿瘤发生机制的研究。     

Glutathione S-transferase pull-down assays using dehydrated immobilized glutathione resin

We have developed an affinity-precipitation technique to facilitate conducting glutathione S-transferase (GST) pull-down assays. The dehydrated immobilized glutathione resin format, when combined with microcentrifuge spin columns, is a powerful tool that enables the simultaneous performance of resin hydration, the binding of the GST fusion protein, and the pull-down step with the appropriate protein partner in a semihigh-throughput fashion (multiple samples processed at the same time). The entire assay process is shortened and recovery is enhanced when coupled with a spin-column format, providing a convenient way to study protein-protein interactions. We successfully tested the resin format/technique in three common pull-down applications utilizing radiolabeled, overexpressed, and activated endogenous interacting protein partners.     

Profiling Eph receptor expression in cells and tissues: A targeted mass spectrometry approach

The Eph receptor tyrosine kinase family includes many members, which are often expressed together in various combinations and can promiscuously interact with multiple ephrin ligands, generating intricate networks of intracellular signals that control physiological and pathological processes. Knowing the entire repertoire of Eph receptors and ephrins expressed in a biological sample is important when studying their biological roles. Moreover, given the correlation between Eph receptor/ephrin expression and cancer pathogenesis, their expression patterns could serve important diagnostic and prognostic purposes. However, profiling Eph receptor and ephrin expression has been challenging. Here we describe a novel and straightforward approach to catalog the Eph receptors present in cultured cells and tissues. By measuring the binding of ephrin Fc fusion proteins to Eph receptors in ELISA and pull-down assays, we determined that a mixture of four ephrins is suitable for isolating both EphA and EphB receptors in a single pull-down. We then used mass spectrometry to identify the Eph receptors present in the pull-downs and estimate their relative levels. This approach was validated in cultured human cancer cell lines, human tumor xenograft tissue grown in mice, and mouse brain tissue. The new mass spectrometry approach we have developed represents a useful tool for the identification of the spectrum of Eph receptors present in a biological sample and could also be extended to profiling ephrin expression.     

腮腺炎病毒F蛋白七肽重复序列的表达、纯化及特性分析

副粘病毒F蛋白的两段七肽重复序列（HR1和HR2）在病毒侵染细胞的过程中相互作用形成热稳定的富含α螺旋的异源二聚体,此结构的形成引起病毒囊膜与细胞膜的并置而最终导致膜融合的发生。腮腺炎病毒（Mumps virus, MuV）属于副粘病毒科,腮腺炎病毒属,可能利用与其他副粘病毒相似的侵染机制。本研究对MuV 融合蛋白的HR区进行了计算机程序预测,并利用大肠杆菌GST融合表达系统对MuV F蛋白HR1和HR2两段多肽进行了表达和纯化,通过GST pull_down 实验证实HR1和HR2多肽在体外能够相互作用,凝胶过滤层析证明HR1、HR2多肽能够形成多聚体,说明MuV F蛋白的HR区的相互作用可能是其发挥融合功能的关键因素。