云南传统发酵豆豉中高产豆豉纤溶酶菌株的筛选及其酶谱分析

从云南昆明、元阳、玉溪、昭通地区采集豆豉样品26个,通过琼脂-纤维蛋白平板试验,SDS-fibrin-PAGE蛋白电泳结合Zymography活性染色对相应酶谱进行分析;同时采用茚三酮法测定其豆豉纤溶酶活性,筛选得到5株豆豉纤溶酶活性较高的菌株,其中尤以ZT-13茵株纤溶酶活性达到97.09 U/mL,是工业化生产豆豉纤溶酶的潜在优良菌株.     

豆豉纤溶酶的研究现状

豆豉纤溶酶是从中国传统风味食品豆豉中分离得到的一种由杆菌产生的丝氨酸蛋白酶,具有极强的纤溶活性.综述了豆豉纤溶酶的产生菌种、发酵工艺、酶学性质、分离纯化、作用机理以及分子生物学特性等研究现状.豆豉纤溶酶在溶栓的过程中有着溶栓能力强,无毒副作用,原材料丰富,在体内半衰期长等优点,因此该酶有着广阔的应用发展前景.     

食品纤溶酶研究概况

溶栓疗法是血栓性疾病安全有效的治疗手段,开发安全高效、廉价的新型纤溶酶对于预防与治疗血栓性疾病具有重要意义。近年来,在许多亚洲传统发酵食品中如日本纳豆、韩国大豆酱、中国豆豉、发酵虾酱等中均发现有丰富的纤溶酶资源。本文重点介绍传统发酵食品中纤溶酶的研究概况及其开发前景。     

蛇毒纤维蛋白（原）溶酶

在蝰亚科、蝮亚科和眼镜科等蛇毒中存在着一类能直接溶解纤维蛋白 (原 )的酶 ,称为纤维蛋白 (原 )溶酶 (简称纤溶酶 ) [1] 。 1 976年 ,Ｏｕｙａｎｇ等第一次从尖吻蝮蛇毒中分离纯化得到纤溶酶[2 ] 。这些纤溶酶可用于溶解在心肌梗塞、中风、血栓等期间形成的血凝块[1] 。作为一种潜在的强有力的抗栓药物 ,纤溶酶已成为蛇毒蛋白酶领域的一个研究热点。1 .蛇毒纤溶酶的分类蛇毒纤溶酶的分类方法主要有 3种 :第一种根据纤溶酶对纤维蛋白原 (ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ ,Ｆｇ)的作用方式 ;第二种是根据纤溶酶的结构特点[3] ;第三种是根据纤溶酶的分…     

豆豉纤溶酶基因在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化(英文)

豆豉纤溶酶是从豆豉中发现的新型纤溶酶.从枯草杆菌DC-12中提取总DNA,PCR法扩增pro-DFE基因.将pro-DFE基因插入载体pET-32a,构建表达质粒pET-pro-DFE,转化大肠杆菌BL21(DE3),对重组菌株进行变温诱导表达,重组菌株于37℃培养至OD600为0.6时,加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG于24℃进行诱导,SDS-PAGE显示可溶性重组融合蛋白约占重组蛋白的60%.且少量融合重组蛋白发生自切割,形成成熟的豆豉纤溶酶,破菌上清中含有成熟的豆豉溶栓酶,纤溶活性为200IU/mL.重组酶经纯化后比酶活为1280IU/mg.     

豆豉纤溶酶产生菌分离和鉴定

从全国各地收集豆豉样品,采用不同的培养基进行富集培养,并利用纤维蛋白平板法高效获得了13株形态差异较大的产纤溶酶菌株。通过传统方法、化学方法以及16S rRNA序列分析对这13株菌进行分类鉴定,它们分属于芽孢杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属以及节杆菌属,包括9种细菌,丰富了豆豉纤溶酶产生菌菌种资源。     

赤爱胜蚯蚓(Eisenib Foetide Sorigng)纤溶酶的研究 1.提取纯化和生物化学性质

采用35％和65％的饱和硫酸铵分级沉淀法,获得蚯蚓纤溶酶活性蛋白,并对其纤溶酶的分子量,纤溶酶对其底物专一性,温度对纤溶酶的影响,纤溶酶最适pH值和pH值稳定性,纤溶酶的等电点,抑制剂对蚓蚯纤溶酶的影响几方面的测定,从而确定了蚯蚓纤溶酶的生物化学性质。     

一株产纤溶酶凝结芽孢杆菌的筛选及其生物学特性

为了筛选性能良好的产纤溶酶菌株,本研究通过脱脂乳平板及纤维蛋白平板双层筛选从传统发酵食品豆豉中,分离到1株具有溶解纤维蛋白能力的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans) HQ-1。分析其发酵上清液中纤溶酶的纤溶能力、组成特征和作用方式,并研究菌株HQ-1生物学特性。结果表明:菌株HQ-1发酵上清液中的纤溶酶活力为383.1 U/mL;Native-PAGE实验表明HQ-1发酵上清液中能溶解纤维蛋白的纤溶酶组分仅有一种,并且通过激活纤溶酶原实现HQ-1降解纤维蛋白。HQ-1生物学特性实验表明:菌株HQ-1对阿莫西林等11种常见抗生素敏感;对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用显著。菌株HQ-1产纤溶酶活性及稳定性较好,具有潜在开发价值,本研究结果为产纤溶酶微生物资源的开发提供理论依据。     

一株新的豆豉纤溶酶产生菌的研究

从全国各地采集豆豉样品,经富集培养并利用纤维蛋白平板法获得一株形态与现存产纤溶酶微生物差异较大的菌株HS9.通过传统方法、化学方法以及16S rRNA序列分析对HS9进行分类鉴定,属于Pseudomonas aeruqinosa,是未见报道的产豆豉纤溶酶菌株.发酵培养HS9获得粗酶,经20%～70%硫酸铵梯度盐析、Sephadex G-75凝胶过滤以及CM-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析分离纯化后,得到了电泳纯酶.通过SDS-PAGE了解该酶分子量约为34 kD,pH 8.0～8.5时酶活性最高,最适作用温度48℃,作用方式为直接水解纤维蛋白,胃蛋白酶抑制剂在工作浓度1μmol/L时能完全抑制其活性,推测该酶为天冬氨酸蛋白酶,是一种新型的豆豉纤溶酶.     

血栓病治疗药物-纤溶酶的生物来源

血栓病的干预方式包括抗血小板凝集、抗凝血和溶栓,对应临床应用的分别是抗血小板、抗凝血酶和纤溶酶溶栓药物;纤溶酶是主要的溶栓类药物,主要用于血栓发病后的治疗。纤溶酶种类多来自于生物体,更多来自于微生物的次级代谢。本文从作用方式、安全性和市场开发等方面总结了国内外纤溶酶的类别、研究现状和发展趋势,并对不同产纤溶酶的微生物菌株类别进行了总结,对不同来源的纤溶酶基因和氨基酸序列等信息进行了比较,发现不同物种的纤溶酶基因虽然有差异,但主要是丝氨酸蛋白酶类,氨基酸序列一致性比较高,说明丝氨酸蛋白酶活性功能区域是相对保守的。