定量蛋白质组学分析链霉素耐药和敏感结核分枝杆菌临床分离株

[目的]发现结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)链霉素耐药相关的潜在菌体蛋白.[方法]以结核分枝杆菌临床分离链霉素敏感株01105和结核分枝杆菌H37Rv为对照,采用iTRAQ技术和生物信息学鉴定并相对定量结核分枝杆菌临床分离链霉素耐药株01108菌体蛋白,并通过WEGO功能注释聚类分析01108菌株差异表达蛋白的细胞组分、分子功能和生物进程.[结果]01108菌株分别与01105菌株和H37Rv菌株比较差异表达蛋白为194个和146个,01108菌株与01105菌株和H37Rv比较均差异表达蛋白121个(共同差异表达蛋白).差异表达蛋白理论相对分子量和等电点分布广泛,其生物进程主要参与中间代谢、呼吸作用和脂质代谢,分子功能主要为催化活性功能和结合功能.共同差异表达蛋白:7个核糖体蛋白(Rv2785c,Rv0056,Rv0641,Rv0652,Rv0701,Rv1630和Rv2442c)在01108菌株中表达下调;7个蛋白在01108菌株中显著差异表达(上调大于1.20倍或下调小于0.55倍),分别为巯基过氧化物酶(Rv1932)、酰基载体蛋白脱氢酶(Rv0824c)、30S核糖体蛋白S15 (Rv2785c)、丙酮酸脱氢酶E2部分(Rv2215)、双组份转录调控蛋白(Rv3133c)以及假定未知蛋白(Rv2466c和Rv2626c).[结论]iTRAQ发现了链霉素耐药结核分枝杆菌相对于链霉素敏感结核分枝杆菌和H37Rv共同差异表达蛋白,为进一步探讨结核分枝杆菌链霉素耐药机制奠定了基础.     

结核分枝杆菌Rv1168c蛋白的基因表达、纯化及结构分析

【目的】应用原核表达体系对结核分枝杆菌PPE蛋白家族Rv1168c进行高效表达,进一步进行蛋白纯化和结构分析。【方法】以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,扩增Rv1168c基因,构建pET32a-Rv1168c重组质粒;转化重组质粒到大肠杆菌DH5α并在BL21(DE3)诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)鉴定Rv1168c在大肠杆菌中的表达情况;Ni-NTAHis﹡Bind Resin纯化重组蛋白Rv1168c;SDS-PAGE和质谱分析测定相对分子量后,用圆二色光谱(CD)和同源模建方法分析和检测重组蛋白Rv1168c的二级和三级结构。【结果】成功克隆了971bp的目的基因Rv1168c,并获得了高纯度的重组蛋白Rv1168c。重组蛋白的分子量为51.5kDa(含载体蛋白)。25℃时重组蛋白Rv1168c的二级结构包括34.4%α螺旋,33.7%β转角,31.9%无规则卷曲,它的三维模型显示为(β/α)5结构。【结论】成功得到高纯度的重组目的Rv1168c蛋白,并初步进行了结构分析,为进一步对Rv1168c结构和功能研究奠定了基础。     

MprAB双组分系统基因在耐药MTB中的表达水平分析

目的:分析结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)临床分离株对4种一线抗结核药物的耐药情况以及结核分枝杆菌双组份系统Mpr AB与MTB耐药性的相关性。方法:收集本地区确诊的结核病患者痰液标本,分离培养得到的MTB菌株进行4种一线抗结核药物异烟肼(Isoniazid,H)、利福平(Rifampicin,R)、链霉素(Streptomycin,S)和乙胺丁醇(Ethambutol,E)的耐药性检测并比较双组分系统Mpr AB编码基因(Mpr A、Mpr B)在MTB标准株(H37Rv)、耐异烟肼(H-MTB)、耐利福平(R-MTB)、耐链霉素(S-MTB)、耐乙胺丁醇(E-MTB)和耐多药(Multi-drug Resistant MTB,M-MTB)菌株中的表达量。结果:分离培养得到72株分枝杆菌,对一种抗结核药物具有耐药性的有19株(H 8株、S 5株、R 3株、E 3株),耐药率为26.39%,对二种及以上耐药的有6株,耐多药率为8.33%(6/72)。Mpr A在H37Rv、H-MTB、R-MTB、S-MTB、E-MTB、M-MTB各组相对表达量分别为:1.12±0.07、3.34±0.42、4.16±0.46、3.09±0.24、2.27±0.18、8.43±0.63,Mpr B在各组相对表达量分别为:5.71±0.59、2.42±0.22、1.47±0.11、2.28±0.23、2.09±0.15、0.54±0.03。Mpr A和Mpr B基因在H37Rv与各耐药组之间比较差异有统计学意义(p0.05),Mpr A和Mpr B基因在各单耐药组与MDR组之间比较有统计学意义,而Mpr A和Mpr B基因在各单耐药组间比较均无统计学意义。结论:Mpr AB双组分系统与MTB耐药性的产生有一定的相关性。     

两株超级广泛耐药结核分枝杆菌全基因组比较分析

【目的】结合现有数据,通过对两株临床超级广泛耐药的结核分枝杆菌全基因组的测序和分析,发现其型别相关的突变位点,解释发生广泛耐药的基因组突变机制。【方法】利用Solexa第二代测序技术对两株广泛耐药结核分枝杆菌(FJ05194和GuangZ0019)进行全基因组测序分析。以H37Rv为参考序列得到两株广泛耐药菌株的单核苷酸多态性(SNPs),构建系统发育树鉴定菌株型别,判断突变位点中型别相关和非型别相关的SNPs。定位SNPs所在的基因组区域,对型别相关的突变基因进行KEGG通路的富集分析,对非型别相关的突变基因和间隔区判断是否与耐药相关。【结果】两株广泛耐药菌株分别属于Lineage2和Lineage4型别,两菌株在碱基替换方面存在差异性,Lineage2型别相关的基因功能富集于ABC转运蛋白和核苷酸切除修复的通路。耐药方面,发现了已知的耐药相关基因的突变(rpoB、katG、rpsl、gyrA、gyrB、embB和ethA等),但卷曲霉素和卡那霉素相关的rrs、tlyA和eis启动子区域未发生突变,不足以解释其耐药性的产生。与最新报道的候选耐药基因比较,发现了卷曲霉素和卡那霉素相关的突变(Rv1393c、Rv0265c和narX等)和外排泵相关的pstB、Rv2333c和Rv2687c突变。【结论】结核分枝杆菌Lineage2型别相关的SNPs中含有影响结核分枝杆菌突变率和耐药性的突变。对于两株超级广泛耐药的结核菌,已知的激活药物或药靶相关的单耐药基因突变集合不能完全解释其广泛耐药性,还涉及新候选结核耐药基因、外排泵和补偿等其他潜在机制的相关基因突变。     

分枝杆菌脂聚糖的分离、纯化及其结构和功能分析

【目的】建立分离、纯化分枝杆菌脂聚糖的方法,初步比较分析不同菌株来源的脂阿拉伯甘露聚糖(Lipoarabinomannan,LAM)和脂甘露聚糖(Lipomannan,LM)的结构差异及研究脂聚糖刺激对巨噬细胞环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)蛋白表达的影响。【方法】应用Triton X-114液相法提取脂聚糖,电洗脱法分离纯化,基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)进行分子量鉴定;基于特异性识别非还原性末端α-D-甘露糖基的刀豆球蛋白(Concanavalin A,Con A)分析新诺分枝杆菌JDM601、结核分枝杆菌H37Rv标准株和耻垢分枝杆菌mc2155脂聚糖的结构差异;进一步用Western blot检测脂聚糖刺激的RAW 264.7巨噬细胞COX-2蛋白的表达。【结果】通过电洗脱法成功纯化出3种菌株脂聚糖;MALDI-TOF/TOF-MS鉴定发现,分子量从小到大依次为新诺分枝杆菌JDM601、耻垢分枝杆菌mc2155和结核分枝杆菌H37Rv来源的脂聚糖。Western blot显示,Con A能与结核分枝杆菌H37Rv标准株来源的LAM相互作用,而不能与新诺分枝杆菌JDM601和耻垢分枝杆菌来源的LAM相互作用;并且发现Con A与新诺分枝杆菌JDM601来源的LM有很强的反应,然而与其余两种来源的LM反应很弱。3种菌株来源的脂聚糖均能刺激RAW 264.7巨噬细胞COX-2蛋白的表达。【结论】首次成功对来源于中国临床分枝杆菌分离株的脂聚糖进行了分离纯化,初步探讨了不同菌株来源分枝杆菌脂聚糖的结构差异,并表明LAM和LM均能刺激巨噬细胞诱导COX-2蛋白的表达,为进一步研究其对宿主的毒力和免疫机制奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv3194c蛋白的亚细胞定位

【目的】Rv3194c基因编码的是结核分枝杆菌的PDZ信号蛋白,本研究探讨该蛋白的亚细胞定位,为其细胞结合蛋白的筛选奠定基础。【方法】从H37Rv基因组中扩增出编码只含有PDZ结构域的tRv3194c (Rv3194c 1–234 aa)的基因片段,在3′端加T2A和EGFP序列,一并插入真核表达载体构建出pcDNA3.1-tRv3194c-T2A-EGFP。将构建好的质粒瞬时转染L929细胞,并共感染重组痘苗病毒vTF7-3,用间接免疫荧光、流式细胞分选以及Western blotting检测融合蛋白的表达以及亚细胞定位。【结果】成功构建出真核表达载体pcDNA3.1-tRv3194c-T2A-EGFP,瞬时转染L929细胞后融合蛋白tRv3194c定位于线粒体膜上,且重组痘苗病毒vTF7-3的感染有助于靶蛋白表达水平的提高。【结论】Rv3194蛋白的PDZ结构域与线粒体外膜相关蛋白结合,为了解该蛋白在细胞内的致病机制提供重要线索。     

结核分枝杆菌中毒素-抗毒素系统的鉴定

【目的】鉴定结核分枝杆菌基因组上MazF同源蛋白基因与其上游基因是否组成毒素-抗毒素系统,阐明毒素蛋白的作用机理,并初步探讨毒素-抗毒素系统在营养缺乏时的表达调控。【方法】在大肠杆菌和耻垢分枝杆菌中将MazF同源蛋白单独表达或与其对应的抗毒素蛋白共同表达,鉴定MazF同源蛋白对细菌生长的抑制作用以及其对应的抗毒素蛋白能否消除这种生长抑制;通过体外RNA切割实验,检测MazF同源蛋白是否具有RNA切割活性;检测正常生长条件下和饥饿条件下毒素-抗毒素系统的启动子活性,探讨其在应激条件下的表达调控。【结果】结核分枝杆菌MazF同源蛋白中,Rv0659c、Rv1495和Rv1942c不具有抑制细菌生长的毒素蛋白活性,Rv1991c、Rv2801c、Rv1102c和mtPemK能够抑制细菌生长,而且它们的抑制作用可以分别被其对应的抗毒素Rv1991a、Rv2801a、Rv1103c和mtPemI解除。Rv1991c、Rv2801c和Rv1102c具有RNA切割活性,mtPemK则不能切割RNA。Rv1991a-1991c和Rv2801a-2801c系统的启动子在饥饿条件下活性显著升高。【结论】结核分枝杆菌基因组上Rv1991a-1991c、Rv2801a-2801c、Rv1103c-1102c和mtPemI-mtPemK是毒素-抗毒素系统。毒素蛋白Rv1991c、Rv2801c和Rv1102c通过切割RNA发挥抑菌或杀菌活性,mtPemK具体作用机理目前还不清楚。Rv1991a-1991c和Rv2801a-2801c系统可能参与结核分枝杆菌在营养匮乏条件下的生长调控。     

结核分枝杆菌Rv3194c蛋白的表达、纯化及活性鉴定北大核心CSCD

【目的】Rv3194c基因编码的是结核分枝杆菌的PDZ信号蛋白,本研究对其是否具有黏附素特性进行了探索。【方法】对Rv3194c进行原核表达,然后Rv3194c蛋白分别与透明质酸、硫酸软骨素、Ι型胶原蛋白在不同温度(37、38、39、40°C)的缓冲液中孵育过夜,然后用Western blot和ELISA分析其上清液中组分含量的变化。【结果】Western blot鉴定结果表明,His-Rv3194c蛋白以可溶形式表达,蛋白质的分子质量大小为35 k Da。Western blot表明,39°C实验组的上清中His-Rv3194c蛋白含量(***P<0.001)显著小于其它实验组(37、38、40°C);ELISA表明,39°C实验组的上清中透明质酸(HA)、硫酸软骨素(CS)、Ι型胶原蛋白(CollagenΙ)的含量(***P<0.001)极显著小于其它实验组(37、38、40°C)。【结论】首次证实了Rv3194c蛋白具有黏附素特性,可成为研发新型抗结核药物的靶点蛋白。     

差显技术分析结核杆菌H37Rv与H37Ra差异表达的基因*

采用差异显示技术比较了结核分支杆菌强毒株H37Rv和弱毒株H37Ra在体外培养条件下的基因表达差异。通过20种引物组合进行mRNA差异显示,克隆到了两菌株间的20余个差异表达基因,经序列分析及杂交鉴定发现其中2个基因仅在H37Rv中表达。其中Rv1894 c基因编码的可能是H37Rv中的一个新蛋白。而在H37Ra的基因组中含有这2个基因的编码序列,但均未检测到基因的表达。     

差显技术分析结核杆菌H37Rv与H37Ra差异表达的基因

采用差异显示技术比较了结核分支杆菌强毒株H37Rv和弱毒株H37Ra在体外培养条件下的基因表达差异。通过20种引物组合进行mRNA差异显示,克隆到了两菌株间的20余个差异表达基因,经序列分析及杂交鉴定发现其中2个基因仅在H37Rv中表达。其中Rv1894c基因编码的可能是H37Rv中的一个新蛋白。而在H37Ra的基因组中含有这2个基因的编码序列,但均未检测到基因的表达。     

Proteomic analysis of sensitive and multi drug resistant <Emphasis Type="Italic">Mycobacterium tuberculosis</Emphasis> strains

Multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) is caused by bacteria that are resistant to the most effective anti TB drugs (Isoniazid and Rifampicin) with or without resistance to other drugs. Novel intervention strategies to eliminate this disease based on finding proteins can be used for designing new drugs or new and reliable kits for diagnosis. The aim of this study was to compare the protein profile of MDR-TB with sensitive isolates. Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) along with mass spectrometry is a powerful and effective tool to identification and characterization of Mycobacterium tuberculosis. Two-dimensional gel electrophoresis and matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry was used for diagnosis and comparison of proteins. We identified 14 protein spots in MDR-TB isolates that 2DE analysis showed these spots absent in M. tuberculosis sensitive isolates (Rv1876, Rv0379, Rv0147, Rv2031c, Rv3597c, Rv1886c, MT0493, Rv0440, Rv3614c, Rv1626, Rv0443, Rv0475, Rv3057 and unknown protein. The results showed 22 protein spots which were up regulated (or expressed) by the MDR-TB isolates, (Rv1240, Rv3028c, Rv2971, Rv2114c, Rv3311, Rv3699, Rv1023, Rv1308, Rv3774, Rv0831c, Rv2890c, Rv1392, Rv0719, Rv0054, Rv3418c, Rv0462, Rv2215, Rv2986c, Rv3248c and Rv1908c)). Two up regulated protein spots were identified in sensitive isolate (Rv1133c and Rv0685). These data will provide valuable clues in further investigation for suitable TB rapid tests or drug targets against drug resistant and sensitive of M. tuberculosis.     

The role of ABC efflux pump,Rv1456c-Rv1457c-Rv1458c,from <Emphasis Type="Italic">Mycobacterium tuberculosis</Emphasis> clinical isolates in China

Recently the ATP-binding cassette (ABC) efflux pumps have been proved to be a major component of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. The objective of this study was to investigate the expression profiles of Rv1456c-Rv1457c-Rv1458c efflux system in clinical isolates of M. tuberculosis and its involvement in drug-resistance mechanisms. Significantly increased mRNA expression of Rv1456c, Rv1457c, and Rv1458c appeared among the clinical isolates (P < 0.05), which are resistant to at least one of the four first-line drugs including rifampin, isoniazid, streptomycin, and ethambutol. In addition, overexpression of this efflux system was more frequently found in multidrug-resistant and extensively drug-resistant M. tuberculosis strains. Therefore, Rv1456c-Rv1457c-Rv1458c efflux pumps may play an important role in drug resistance of treatment of M. tuberculosis. Further investigation of this gene may lead to the development of countermeasures against M. tuberculosis drug resistance.     

START家族Rv0164蛋白在耻垢分枝杆菌中的表达及垂钓互作蛋白

【目的】START家族蛋白的突变或者错误表达使哺乳动物产生肾上腺皮质增生、乳腺癌和结肠癌等疾病;START家族蛋白是植物发育过程中重要的调节因子;尚未阐明START家族蛋白作为细菌必需基因的作用机制。结核分枝杆菌必需基因Rv0164属于START家族,功能未知,研究Rv0164作用机制将为START家族分子机制增添新理论。【方法】生物信息学方法分析Rv0164序列特征;模式菌耻垢分枝杆菌中表达Rv0164并分析蛋白的细胞定位;Co-immunoprecipitation(Co-IP)方法垂钓Rv0164的相互作用蛋白,质谱鉴定互作蛋白,酵母双杂交和Pull down验证蛋白相互作用。【结果】Rv0164的N端17个氨基酸在分枝杆菌中不保守;Rv0164无信号肽;Rv0164定位在细胞质中,受蛋白降解机制调控,该机制在细菌生长平台期比对数期活性弱;N端缺失使Rv0164在平台期和对数期均不稳定;Rv0164结合多个胞内蛋白。【结论】Rv0164的N端肽段增加了蛋白的稳定性;Rv0164是一个胞内蛋白;Rv0164能够结合细菌生存必需蛋白。     

利用蛋白质组学研究新德里金属b-内酰胺酶1对鲍曼不动杆菌的影响

【目的】比较临床分离的亲缘关系近的多药耐药鲍曼不动杆菌MDR-ZJ06(blaNDM-1–)和ABC3229(blaNDM-1+)的差异蛋白质组,以期发现新德里金属?-内酰胺酶1(New Delhimetallo-β-lactamase-1,NDM-1)对鲍曼不动杆菌生长代谢的影响。【方法】利用2-DE联合MALDI-TOF MS/MS技术鉴定差异表达蛋白,并在GO注析的基础上,对差异蛋白进行通路分析、功能分类和富集分析,并作出蛋白与蛋白相互作用网络。【结果】发现ABC3299相对于MDR-ZJ06有51个差异表达蛋白,其中11个蛋白表达上调,40个蛋白表达下调,并且这些差异蛋白主要涉及降低碳代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢和细胞壁合成,增加铁离子转运系统形成。【结论】这个结果揭示了NDM-1可能是通过减缓细菌自身的代谢,增加自身铁的摄取使细菌机体系统地抵抗抗生素从而达到耐药。     

巴斯德毕赤酵母甲醇诱导表达磷脂酶A2的转录组学分析

【目的】基于转录组学技术研究表达磷脂酶A_2的毕赤酵母重组菌在甲醇诱导表达外源蛋白时的基因表达差异,从而解析外源蛋白高效诱导表达机制,为进一步工程菌株的改造提供理论支撑。【方法】以一株产磷脂酶(PLA_2)的毕赤酵母为出发菌株,采用RNA-Seq二代测序方法,研究在甘油培养和甲醇诱导两种条件下,重组毕赤酵母转录组基因表达差异情况。【结果】重组毕赤酵母中共鉴定到5225个转录本。甘油培养与甲醇诱导相比,共有857个基因发生显著变化。依据代谢途径分类,差异基因集中在核糖体成分、甲醇代谢、磷酸戊糖途径、糖酵解途径、柠檬酸循环、乙醛酸循环以及蛋白质加工过程。【结论】通过分析甲醇诱导前后的差异表达基因,结果表明碳源改变对胞内代谢会产生全局影响。本研究结果为进一步研究毕赤酵母表达外源蛋白的机制提供了基础。     

通辽地区犊牛腹泻大肠杆菌耐药性检测及一株多重耐药菌全基因组测序分析

【背景】大肠杆菌(Escherichia coli)是引起犊牛腹泻的最主要病原菌,其耐药性菌株的不断出现引起广泛关注。【目的】了解内蒙古自治区通辽市犊牛腹泻大肠杆菌耐药性及耐药基因流行情况。【方法】从通辽市多个旗县采集犊牛腹泻样品40份,经细菌分离纯化及16S rRNA基因测序,最终鉴定出20株大肠杆菌。采用药敏试验和PCR方法对分离菌进行耐药性及耐药基因检测分析,并对其中1株多重耐药菌株进行全基因组测序。【结果】20株分离菌均具有多重耐药性,对链霉素、环丙沙星、恩诺沙星和复方新诺明的耐药率达80%以上。所检耐药基因中,aphA1、strB、TEM-1和qnrS检出率达100%。通过对代表性菌株TL-13全基因组测序发现,其基因组大小为4897185bp,GC含量为50.68%,同时携带2个质粒,大小分别为108288bp(pTL13-1)和64018bp(pTL13-2)。质粒中共携带18个可移动耐药基因。【结论】通辽地区犊牛腹泻大肠杆菌多重耐药性普遍存在,4种常见耐药基因普遍流行。     

Antimycobacterial activity: synthesis of novel 3-(substituted phenyl)-6,7-dimethoxy-3a,4-dihydro-3H-indeno[1,2-c]isoxazole analogues

In this study, a series of novel 3-(substituted phenyl)-6,7-dimethoxy-3a,4-dihydro-3H-indeno[1,2-c]isoxazole analogues were synthesized and evaluated for antimycobacterial activity against Mycobacterium tuberculosis (MTB) H₃₇Rv and isoniazid resistant M. tuberculosis (INHR-MTB). All the newly synthesized compounds were showing moderate to high inhibitory activities. The compound 6,7-dimethoxy-3-(4-chloro phenyl)-4H-indeno[1,2-c]isoxazole (4b) was found to be the most promising compound, active against MTB H₃₇Rv and INHR-MTB with minimum inhibitory concentrations of 0.22 and 0.34 μM.     

分离自母婴肠道的假小链双歧杆菌的耐药性分析

【背景】由于滥用抗生素导致细菌耐药性日益严重。对于双歧杆菌,人们往往注重其益生功能的挖掘而忽视了对其耐药性的研究,存在一定的安全隐患。【目的】检测母婴肠道中假小链双歧杆菌的耐药性,探究婴儿肠道中假小链双歧杆菌耐药性的来源。【方法】利用微量肉汤稀释法测定48株分离自母婴肠道的假小链双歧杆菌对14种抗生素的耐药性,比较分离自不同家庭母婴肠道中假小链双歧杆菌的耐药性。【结果】48株母婴肠道分离株对四环素、氯霉素、新霉素、环丙沙星100%耐药,对其余10种抗生素耐药率依次为：卡那霉素98%、利福平80%、克林霉素78%、甲氧苄啶63%、红霉素59%、庆大霉素43%、链霉素16%、万古霉素14%、氨苄西林6%、利奈唑胺2%。母婴肠道分离株的耐药性无显著差异,分离自同一家庭母婴肠道的菌株具有相似的耐药表型。【结论】分离自母婴肠道的假小链双歧杆菌对多种抗生素具有耐药性,婴儿肠道中假小链双歧杆菌的耐药性可能是由母亲肠道垂直传递而来。