体细胞核移植生产转ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1克隆猪

转ω-3脂肪酸去饱和酶基因猪在优质猪培育及研究ω-3不饱和脂肪酸预防心血管和癌症疾病中的作用方面有着重大的应用．本研究首次通过体细胞核移植制备了转线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1猪．将sFat—1基因转染到大白猪胎儿成纤维细胞,获得转基因阳性细胞克隆,然后以转基因细胞为核供体、体外成熟的猪卵母细胞为核受体构建克隆胚胎,胚胎体外培养或进行移植．先后移植了1889枚1-4细胞期克隆胚胎到10头受体母猪的输卵管内,28天B超检测9头受体母猪妊娠（90％）,7头妊娠足月（70％）分娩产下21头仔猪,体细胞克隆猪的效率为1．1％（出生仔猪／移植胚胎）．体细胞克隆猪效率的提高,主要是对克隆胚胎的移植环节进行了改进,比较了受体母猪排卵状况对胚胎移植效率的影响．当受体母猪卵泡发育处于即将排卵或正在排卵阶段,能够获得较高的妊娠率和妊娠足月率（100％）,而排卵后移植妊娠足月率为0％．对健康存活15头克隆猪进行了PCR和Southern检测,证实13头为转基因猪,转基因阳性率为87％．RT—PCR检测13头转基因猪,12头表达sFat—1基因．以上结果表明,利用优化的体细胞转基因结合核移植技术,可以成功地批量生产转sFat-1基因的克隆猪．     

转Fat-1基因猪的制备和整合检测

为了在转基因猪肌肉中高效率表达Fat-1基因,且进一步得到富含ω-3 PUFAs猪品系建立技术基础。将化学合成的人源化Fat-1基因克隆到表达载体上,构建能够在猪细胞中高效表达的质粒构件p MSTN-ω3,使用胚胎原核显微注射方法制备转h Fat-1基因猪。试验对16头供体母猪超数排卵,人工授精配种后手术法冲取320枚1~2细胞期猪胚胎。原核显微注射法向胚胎导入线性化质粒p MSTN-ω3,302枚1~2细胞期胚胎显微注射后移植10头受体母猪,5头母猪妊娠,生产26头仔猪。PCR法检测得到4头转h Fat-1基因阳性猪,Southern印迹杂交分析验证1头猪整合有h Fat-1基因,1头猪近似整合h Fat-1基因。有1头h Fat-1基因整合猪可用于转基因猪育种,表达构件p MSTN-ω3能够用于生产转Fat-1基因猪。试验成功采用显微注射法制备转h Fat-1基因猪,改进、规范了胚胎原核显微注射法制备转基因猪的试验操作程序。     

延迟激活对猪克隆胚胎体外、体内发育效率的影响

为了提高猪克隆效率,获得更多的克隆猪,研究了延迟激活对猪体细胞克隆胚胎体外、体内发育的影响。研究发现,和同步融合激活方法相比,延迟激活虽然会降低克隆重构胚的融合率(P 0. 05),但能够显著提高克隆胚胎的卵裂率(P 0. 01)和囊胚率(P 0. 05);延迟激活方法重构胚使用CB辅助激活4h,其囊胚率均极显著高于不使用CB组(P 0. 01);将克隆胚胎移植到126头受体母猪后,延迟激活组受体母猪分娩率显著高于同步激活组(P 0. 05),虽然在窝均总仔、窝均活仔、克隆效率方面没有显著差异,但延迟激活组显然获得了更多的克隆仔猪。以上结果说明,延迟激活方法能够提高猪克隆胚胎的体外、体内发育效率。     

广西巴马小香猪体细胞克隆

本研究旨在检验新生广西巴马小香猪肾脏成纤维细胞支持克隆胚胎完全的体内发育潜能,亦即能通过其构建出存活的克隆猪,从而为克隆技术在广西巴马小香猪资源保存和开发上的应用奠定基础。首先制备新生雄性广西巴马小香猪肾脏成纤维细胞,用其制备体细胞核移植胚胎,追踪观察体细胞核移植胚胎体外发育潜能,最后通过胚胎移植检验其完全的体内发育潜能。实验结果表明,制备的新生雄性广西巴马小香猪肾脏成纤维细胞具有良好的细胞增殖活性,用其制备的体细胞核移植胚胎分裂率和囊胚率分别为77.7%(334/430)和16.5%(71/430),将1 658枚克隆胚胎移植给6头代孕母猪,其中2头妊娠并最终产下8头存活雄性克隆小猪和3头死胎,整体克隆效率为0.66%,存活克隆猪健康状况良好。本研究表明,新生猪肾脏成纤维细胞是一种理想的用于生产体细胞克隆广西巴马小香猪的细胞资源。     

克隆猪技术及其在转基因猪研究中的应用

哺乳动物核移植技术是一种可以获得基因组遗传信息完全相同的后代的生物技术。猪体细胞核移植技术包括以下几个环节：卵母细胞的体外成熟、供体细胞的分离和处理、体细胞的核转移、重构胚胎的人工激活、胚胎体外培养和胚胎移植。由于该技术在最近几年的迅速发展,很多实验室已通过该技术成功获得了克隆猪后代。核移植克隆猪技术的出现为生产转基因猪提供了一种有效的方法,并且是目前生产基因打靶猪的惟一方法。至今利用克隆猪技术已经成功获得了一系列的转基因猪和基因敲除猪。以核移植技术产生基因修饰猪目前正处于从基础研究走向应用的过渡阶段。尽管猪体细胞核移植克隆的效率（出生克隆猪数占所用卵数的比例）还不高,但是由于通过该技术能够对猪基因组进行特定的修饰,确保生产的克隆动物100％为转基因动物,从而大大提高了转基因猪的制作效率,可以预料猪核移植技术将会对医药业和农业产生重大的影响。     

Scriptaid处理可提高近交系五指山猪克隆胚胎的发育能力和克隆效率

为探讨一种新型低毒的组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid处理克隆胚胎时对其发育能力和克隆效率的影响,本研究以近交系五指山小型猪胎儿成纤维细胞为供体细胞进行体细胞核移植构建重构胚胎,重构胚胎激活后培养在添加Scriptaid不同浓度(0～300 nmol/ L)的胚胎培养液中培养不同的时间(0～36 h),观察克隆胚胎的卵裂率和囊胚率,评价克隆胚胎体外的发育能力.实验结果发现100 nmol/L Scriptaid处理24 h组克隆胚胎的囊胚发育率(30.4%)较对照组(17.5%)显著提高,P<0.05.将100 nmol/L Scriptaid处理24 h组克隆胚胎和对照组胚胎分别移植到4头受体母猪中,进一步观察其体内的发育能力.处理组克隆胚胎的受体在平均窝产仔数和克隆效率(分别为5头,2.4%)均显著高于对照组(分别为1.5头,0.7%),P<0.05.以上结果表明,100 nmol/L Scriptaid处理24 h近交系五指山小型猪克隆胚胎,有利于提高克隆胚胎的发育能力和克隆效率.     

体细胞克隆猪的研究进展

哺乳动物克隆不仅可以保护濒危动物 ,而且与干细胞工程技术相结合能应用于克隆性治疗 ,是目前生物技术领域研究的热点之一 ,具有重大的科学意义和应用价值。由于体细胞克隆猪在人类器官移植方面具有巨大的应用潜力 ,已成为当今体细胞克隆研究的热点。从 2 0 0 0年开始 ,在不同国家相继诞生了体细胞克隆猪及转基因猪 ,但是其成功效率很低 ( 1 %～ 2 % )。主要综述了影响体细胞克隆猪的几个因素 ,涉及胞质受体、供核细胞、显微操作、激活以及重组胚移植     

体细胞核移植克隆民猪: 培养液对卵母细胞成熟及胚胎发育的影响

体外培养成熟的卵母细胞是进行克隆猪研究所需受体卵母细胞的主要来源, 卵母细胞成熟质量与体细胞核移植胚胎发育能力关系密切. 为提高卵母细胞体外成熟率和成熟质量, 进而提高体细胞核移植猪的成功率, 本实验以改进的TCM199培养液为基础液(T), 分别添加10%的猪卵泡液(T+pFF)和 10%的胎牛血清(T+FBS)后进行卵母细胞成熟培养, 以成熟率和体细胞核移植胚胎发育率等重要指标为标准, 研究了pFF和FBS对卵母细胞成熟及核移植胚胎发育能力的影响. T, T+pFF和T+FBS组在成熟培养后42 h卵母细胞成熟率分别为(53.2±3.8)%, (69.7±3.8)%和(70.2±3.7)%, 添加10%的pFF和FBS显著(P<0.05)提高了卵母细胞成熟率; 3组不同成熟培养液获得的成熟卵母细胞在体细胞核移植后囊胚发育率差异不显著, 但T+pFF组的囊胚细胞数(34.5±2.24)显著(P<0.05)高于T组的囊胚细胞数(26.6±1.25). 来自T+pFF组的体细胞核移植胚胎经手术法移植入发情周期为第0天或第1天的18头受体母猪输卵管, 其中有3头受体母猪妊娠发育到期, 获得克隆民猪14头, 其中有6头健康成活至今. 实验结果表明, 培养液中添加10%pFF可以有效提高卵母细胞成熟比例和成熟质量, 在含有10% pFF培养液中获得的成熟卵母细胞具有支持核移植胚胎全程发育的能力.     

体细胞核移植克隆民猪: 培养液对卵母细胞成熟及胚胎发育的影响

体外培养成熟的卵母细胞是进行克隆猪研究所需受体卵母细胞的主要来源, 卵母细胞成熟质量与体细胞核移植胚胎发育能力关系密切. 为提高卵母细胞体外成熟率和成熟质量, 进而提高体细胞核移植猪的成功率, 本实验以改进的TCM199培养液为基础液(T), 分别添加10%的猪卵泡液(T+pFF)和 10%的胎牛血清(T+FBS)后进行卵母细胞成熟培养, 以成熟率和体细胞核移植胚胎发育率等重要指标为标准, 研究了pFF和FBS对卵母细胞成熟及核移植胚胎发育能力的影响. T, T+pFF和T+FBS组在成熟培养后42 h卵母细胞成熟率分别为(53.2±3.8)%, (69.7±3.8)%和(70.2±3.7)%, 添加10%的pFF和FBS显著(P<0.05)提高了卵母细胞成熟率; 3组不同成熟培养液获得的成熟卵母细胞在体细胞核移植后囊胚发育率差异不显著, 但T+pFF组的囊胚细胞数(34.5±2.24)显著(P<0.05)高于T组的囊胚细胞数(26.6±1.25). 来自T+pFF组的体细胞核移植胚胎经手术法移植入发情周期为第0天或第1天的18头受体母猪输卵管, 其中有3头受体母猪妊娠发育到期, 获得克隆民猪14头, 其中有6头健康成活至今. 实验结果表明, 培养液中添加10%pFF可以有效提高卵母细胞成熟比例和成熟质量, 在含有10% pFF培养液中获得的成熟卵母细胞具有支持核移植胚胎全程发育的能力.     

曲古抑菌素A对克隆猪端粒长度的影响

端粒是染色体末端结构,在细胞分裂时随着DNA复制而缩短,体细胞核移植能不同程度地延长端粒长度,但有些克隆动物端粒的长度在体细胞核移植过程中不能有效恢复,因而这些克隆动物就会表现出早衰现象。文章发现克隆东北民猪以及eGFP、Mx和PGC1α转基因克隆猪的端粒长度与核供体成体成纤维细胞相比显著缩短(P<0.05),表明体细胞核移植的重编程过程没能延长细胞的"寿命"。曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)是一种去乙酰化酶抑制剂,有研究表明其能提高某些物种的体细胞核重编程效率。为了使端粒长度有效恢复,文章利用40 nmol/L TSA处理1细胞期猪克隆胚胎24 h,结果发现,与对照组相比,TSA处理能显著地提高克隆胚胎体外发育的囊胚率(16.35%vs.2 7.09%,21.60%vs.34.90%,P<0.05),而且囊胚期端粒长度也得到显著延长(P<0.05)。克隆胚胎移植受体后得到了TSA处理组与非处理组的克隆猪,虽然TSA处理并没有提高克隆效率(1.3%vs.1.7%,TSA vs.control),但端粒长度与对照组和供体细胞相比均显著延长(P<0.05)。猪体细胞核移植不能有效恢复端粒长度,但是TSA处理能有效延长克隆猪端粒长度。