靶向Ang2的RNAi慢病毒载体的构建及其对恶性黑色素瘤细胞中Ang2基因表达的影响

目的 构建携带促血管生成素2-小干扰RNA（Ang2-siRNA）慢病毒载体,观察其对恶性黑色素瘤细胞中Ang2基因表达的干扰作用.方法 将经XbaⅠ酶切电泳鉴定的带有加强绿色荧光蛋白的转移质粒（pNL-EGFP）载体与pSilencer 1.0-U6启动子-促血管生成素2-小干扰RNA（pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA）重组质粒连接,产生加强绿色荧光蛋白的转移质粒-U6启动子-促血管生成素2-Ⅰ（pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ）、加强绿色荧光蛋白的转移质粒-U6启动子-促血管生成素2-Ⅱ（pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ）慢病毒转移质粒,电泳筛选阳性克隆,测序鉴定.用连接成功的慢病毒转移质粒、水疱性口炎病毒G蛋白（pVSVG）包膜质粒和pHelper包装质粒共转染293T细胞,产生pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ、pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ慢病毒.收集病毒上清,测定病毒滴度.将收集的病毒上清感染恶性黑色素瘤细胞,通过实时荧光定量RT-PCR测定抑制Ang2基因表达的效率.结果 酶切电泳与测序鉴定证实成功构建了Ang2-SiRNA慢病毒载体,293T细胞测定病毒原液滴度为8.0×103/ml.实时荧光定量RT-PCR结果显示：Ang2-siRNA慢病毒载体感染恶性黑色素瘤细胞,抑制了恶性黑色素瘤细胞中Ang2基因的表达（P＜0.05）.结论 成功构建了Ang2-SiRNA慢病毒载体,体外研究显示Ang2-SiRNA慢病毒载体能抑制恶性黑色素瘤细胞中Ang2 mRNA的表达,为下一步进行裸鼠恶性黑色素瘤移植瘤生长的干预实验奠定基础,为肿瘤的基因治疗提供实验依据.     

丹参对冻融入胎儿卵巢组织异种移植早期血管生成的影响

目的：研究冻融人胎儿卵巢组织移植早期血管生成过程中微血管形态和密度的改变以及血管生成相关基因mRNA的表达;探讨丹参注射液对移植物血管生成的影响。方法：冻融胎儿卵巢组织异种移植至裸鼠肾被膜下,按给药不同分为对照组（生理盐水）和丹参组（丹参注射液每只0．09g／d）,分别于移植后48h、7d和28d回收移植物。结果：移植后两组卵巢组织微血管密度均明显增多;对照组移植后7d血管密度达峰,丹参组血管密度在移植后48h即已显著上升,此后两个时间段保持相对平稳。Angiopoietin-2mRNA表达在移植后48h两组均显著升高,丹参组上升幅度大于对照组（P〈0．05）。结论：冻融人胎儿卵巢组织新血管生成开始于异种移植后48h内,移植后7d组织内微血管密度达峰。丹参在移植早期应用可以促进移植后血管生成,其机制可能与它增加了血管生成相关因子Ang-2mRNA的表达有关。     

Ang2、Tie2基因的RNA干扰及其在体外抑制血管生成的作用

目的：探讨应用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术沉默Ang2、Tie2基因及其在体外抑制血管生成的研究,为将来进一步进行抑制肿瘤血管生成的动物实验研究奠定基础,为肿瘤的基因治疗提供实验依据。方法：用pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs),采用RT PCR检测各组HUVECs Ang2、Tie2的mRNA表达状况。应用体外血管生成的三维培养模型研究转染后的HUVECs在体外形成血管样结构的情况。结果：pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒转染HUVECs后,RT-PCR检测结果显示: Ang2、Tie2基因mRNA的表达水平均受到明显抑制（P<0.05）,并且siRNA的2条重组质粒之间均无明显差别（P>0.05）。转染后的HUVECs在体外三维培养模型中血管样结构形成的数量和长度均明显减少（P<0.05）,表明血管生成受到明显抑制。结论：Ang2-siRNA、Tie2-siRNA能够抑制HUVECs中Ang2和Tie2的mRNA表达,从而在体外抑制血管生成。     

shRNA靶向干扰COX-2抑制人肝癌裸鼠皮下移植瘤及其血管生成

目的:探讨重组干扰质粒pshRNA-COX-2对人肝癌细胞Hep3B裸鼠皮下移植瘤生长和肿瘤血管生成的抑制作用。方法:重组干扰质粒pshRNA-COX-2转染Hep3B细胞并筛选后,RT-PCR和Western blot检测COX-2mRNA和蛋白表达,RT-PCR检测VEGFmRNA表达。将被成功转染的Hep3B细胞种植于裸鼠皮下,测量肿瘤大小,4周后处死裸鼠,免疫组织化学法检测肿瘤组织中COX-2蛋白表达和肿瘤微血管密度(MVD)。结果:与未转染细胞相比,干扰组COX-2mRNA和蛋白表达抑制率分别为65.3%和52.8%(P<0.05),干扰组VEGFmRNA表达抑制率为56.5%(P<0.05)。干扰组瘤体大小明显小于阴性组和空白组(P<0.01)。干扰组COX-2得分和MVD均明显低于阴性组和空白组(P<0.01)。结论:pshRNA-COX-2通过抑制COX-2表达明显抑制人肝癌细胞Hep3B裸鼠皮下移植瘤生长和肿瘤血管生成。     

敲减血管内皮生长因子受体-2表达抑制人乳腺癌裸鼠移植瘤的生长

应用化学修饰的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)抑制裸鼠乳腺癌移植瘤血管内皮生长因子受体-2基因（VEGFR2,又称kinase insert domain-containing receptor, KDR)的表达, 探讨抑制肿瘤血管生成对人乳腺癌(MCF-7)裸鼠移植瘤生长的影响．雌裸鼠皮下种植MCF 7 细胞,肿瘤长至一定大小时, 随机分为对照组（A）、转染试剂对照组（B）、小剂量治疗组（C）及大剂量治疗组（D）．肿瘤局部分别注射葡萄糖溶液、In vivo jetPEI^TM转染试剂和In vivo jetPEI^TM转染试剂包裹的KDRsiRNA．22 d后处死全部动物, 取肿瘤, 测其大小及重量, HE 及免疫组化染色,微血管密度计数,同时用RT-PCR检测KDR基因的表达水平．结果显示,siRNA治疗组瘤组织的增长受到明显抑制;HE染色显示,治疗组肿瘤中心区出现大面积细胞坏死;免疫组化结果显示,染色阳性血管数明显低于对照组;同时RT-PCR结果表明,治疗组KDR表达下调．对照组各指标无显著变化．因此,化学修饰的siRNA介导的RNAi可以降低人乳腺癌裸鼠移植瘤血管中KDR 表达, 抑制血管生成进而抑制肿瘤的生长,是潜在的肿瘤治疗新方法．     

氢氧化钠瘤内注射通过抗血管生成作用抑制肝癌生长的机制研究

目的：研究氢氧化钠溶液瘤内注射对肝癌的生长抑制作用并探索其机制。方法：对SMMU-LTNM肝癌裸鼠皮下模型进行2%浓度的氢氧化钠溶液瘤内注射,检测肿瘤组织微血管密度、HIF-1α和VEGF的表达情况。结果：与生理盐水瘤内注射组相比,氢氧化钠显著抑制肿瘤生长（P〈0.01）、降低肿瘤微血管密度（P=0.01）、抑制肿瘤组织HIF-1α和VEGF的表达（P=0.02和P=0.01）。结论：氢氧化钠瘤内注射可有效抑制肝癌生长,主要机制可能是抗血管生成作用。     

茶多酚联合吉非替尼抗肺腺癌血管生成的初步研究

目的:通过观察茶多酚联合吉非替尼对人肺腺癌生长的抑制作用.验证茶多酚抗肿瘤血管生成效应.方法:建立人肺腺癌A549移植瘤模型.设立对照组、茶多酚组、吉非替尼组及两者联合组.观察对肺腺癌A549移植瘤的抑制率,检测移植瘤体的微血管密度;并观察EGFR-VEGF这一肿瘤血管生成重要通路的相关因子VEGF、AKT-2、HIF-1a和STAT-3表达水平.结果:茶多酚组、吉非替尼组对移植性人肺腺癌A549瘤体、肿瘤组织微血管密度及VEGF的表达都有明显的抑制效果;两者联合使用效果明显增强;茶多酚组、吉非替尼组能明显抑制AKT-2、HIF-1a和STAT-3表达水平,但两者联合组对AKT-2、HIF-1a作用并不明显,而能明显抑制STAT3表达.结论:茶多酚、吉非替尼对移植性人肺腺癌A549具有明显的抑制效果,两者联合使用有一定增效作用,并能够影响肿瘤血管生成通路的相关因子表达.     

血管形成在双歧杆菌预防大肠癌生长中的作用

目的 从血管形成角度探索青春型双歧杆菌预防大肠癌生长的途径。方法 建立大肠癌裸鼠移植瘤模型,以免疫组化法检测大肠癌组织血管内皮生长因子（VEGF）的蛋白表达水平及其微血管密度（MVD）。结果 双歧杆菌预防组大肠癌VEGF的阳性细胞密度及MVD的数量均明显低于肿瘤对照组（P〈0．01）。结论 青春型双歧杆菌能下调大肠癌VEGF的表达,进而抑制其血管形成,这可能是它预防大肠癌生长的途径之一。     

骨桥蛋白RNA干扰对人U251胶质瘤细胞在裸鼠体内生长的影响

研究下调骨桥蛋白(osteopontin,OPN)对人U251胶质瘤细胞在裸鼠体内生长的影响并探讨其对胶质瘤生长、侵袭的可能机制.应用RNA干扰技术,将OPN基因的慢病毒干扰载体LV-OPNshRNA感染U251细胞.将对照和试验组U251细胞分别接种裸鼠,建立裸鼠荷瘤模型.3周后测量肿瘤的体积、瘤重并做肿瘤组织病理切片分析;利用RT-PCR和免疫印迹法检测OPN、尿激酶型纤维蛋白酶原激活物(uPA)、基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)的mRNA和蛋白表达;免疫组化法检测肿瘤组织微血管密度和血管内皮生长因子（VEGF）表达情况. 经OPN的RNA干扰后,能显著降低肿瘤组织OPN mRNA水平及蛋白表达,有效抑制肿瘤细胞生长及侵袭能力, 肿瘤体积及重量的减小有统计学意义(P<0.05).感染组uPA、MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白表达明显减少, 肿瘤组织的MVD值和VEGF的表达均显著降低.上述结果表明,抑制OPN的表达能明显抑制人U251胶质瘤细胞在裸鼠体内的生长和侵袭,OPN可能通过激活uPA、MMP-2和MMP-9等蛋白酶降解细胞外基质和促进肿瘤血管生成,参与胶质瘤的生长.     

VEGF—A和VEGF—C在皮肤恶性黑色素瘤表达的临床病理意义

目的：内皮细胞生长因子（Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）与恶性肿瘤转移密切相关,研究发现VEGF过度表达与恶性黑色素瘤转移有关,在本研究中通过研究VEGF在恶性黑色素瘤中的表达及与临床病理指标的相关性,为以VEGF为靶的抗转移治疗提供依据。方法：应用免疫组织化学技术检测恶性黑色素瘤中VEGF-A和VEGF-C表达,及与临床病理特点和生存状态的关系。结果：VEGF—A在皮肤恶性黑色素瘤中的阳性表达率是83．33％（30／36）,在色素痣中阳性表达率是15％（3／20）,两组间有显著性差异（P〈O．05）。VEGF—C在皮肤恶性黑色素瘤中的阳性表达率是88．9％（32／36）,在色素痣中阳性表达率是10％（2/20）,两组间有显著性差异（P〈0．01）。VEGF-A和VEGF—C表达与年龄、性别、肿瘤形态、肿瘤大小无显著关系,但与淋巴结转移和封闭血管环形成有关,VEGF-A和VEGF—C阳性病例淋巴结转移率和封闭血管环出现率显著高于VEGF-A和VEGF-C阴性病例。有统计学意义。对VEGF-A和VEGF-C表达与恶性黑色素瘤生存状态的关系分析显示,VEGF-A和VEGF-C表达阴性的病例的生存期和生存率均显著高于VEGF-A和VEGF-C表达阴性的病例,有统计学意义。结论：VEGF-A和VEGF-C表达与恶性黑色素瘤的淋巴结转移、血管形成和生存期相关,这两种蛋白过度表达反映黑色素瘤处于进展状态和预后差,可以作为黑色素瘤诊断、预后和复发预测的指标和靶向治疗的靶蛋白。     

Interfering growth of malignant melanoma with Ang2-siRNA

To investigate the intervention therapy effect on the growth of malignant melanoma, we have made an observation of expression levels of Ang2 in malignant melanoma cells, which was transduced by small interfering RNA (Ang2-siRNA) of Ang2 in vitro and in vivo. We successfully constructed Ang2-siRNA lent virus, and constructed nude mice model by transplanting malignant melanoma. Ang2-siRNA lent virus inhibited Ang2 mRNA of malignant melanoma in vitro and in vivo, and inhibited malignant melanoma tumor growth at the same time. Ang2-siRNA lent virus can interfere expression levels of Ang2 in malignant melanoma cells, inhibit tumor growth, and silent Ang2 gene expression, which may pave a new way for clinical gene therapy of malignant melanoma.     

抗VEGFR-2嵌合Fab抗体对裸鼠肝癌原位移植瘤新生血管生成的影响

目的:检测抗VEGFR-2嵌合Fab抗体对裸鼠肝癌原位移植瘤血管生成的影响.方法:建立裸鼠肝癌H22细胞原位移植瘤模型,随机分成生理盐水组(n=12)和抗体组(n=12).采用免疫组织化学SP染色法对两组肝脏移植瘤进行血管染色,观察其微血管密度(MVD)情况.结果:成功建立裸鼠H22肝癌原位移植瘤模型,HE染色显示肝脏移植瘤为肝细胞肝癌,免疫组化结果显示肝脏实体瘤内微血管密度抗体组较生理盐水组显著性减少(25.64± 1.53 vs 8.65± 1.79,P＜0.05).结论:抗VEGFR-2嵌合Fab抗体能够抑制裸鼠肝癌原位移植瘤的血管生成.     

慢病毒介导的TNF-α-SiRNA在C型Niemann-Pick病小鼠脑部的表达及功能

目的探讨TNF-α（tumor necrosis factorα,肿瘤坏死因子α）在C型Niemann-Pick病（NPC）小鼠脑部的表达及功能。方法对4周龄NPC小鼠侧脑室注射包装成功的慢病毒,观察4周,分为未干预组（n=4）、对照病毒组（n=6）和TNF-α-SiRNA（n=6）组,观察慢病毒在脑部的表达并采用免疫组化、实时定量PCR检测其下调目的基因的效果。结果慢病毒可以长期、稳定的表达在NPC小鼠脑部;免疫组化以及realtime-PCR结果显示,与未干预组及对照病毒组相比,TNF-α-SiRNA组目的基因明显下调。结论在体研究显示TNF-α-siRNA能明显下调TNF-α的表达,为研究和治疗神经变性疾病以及TNF-α相关疾病提供了有力的工具。     

贝伐单抗对ALA—PDT诱导的新生血管形成和胶质瘤生长的影响

探讨贝伐单抗对低剂量5-氨基乙酰丙酸（5-Aminolevulinicacid,ALA）介导的光动力学疗法（photodynamic therapy,PDT）诱导的脑组织新生血管形成和U87脑胶质瘤生长的影响。通过将裸小鼠随机分为对照组、ALA．PDT预处置组（ALA：2．3×10-3mol／kg,能量密度：10J／cm2）、贝伐单抗预处置组（1．6×10-5mol／kg）和联合预处置组（ALA—PDT＋贝伐单抗）,并接受相应处置。第10d,检测PDT照射及相应区域内新生血管形成和VEGF表达并种植U87脑胶质瘤细胞,21d后观察肿瘤体积。与对照组比较,低剂量ALA-PDT预处置后新生血管增多、VEGF表达增高,肿瘤体积增大,这些变化在联合预处置组被抑制;贝伐单抗预处置组的血管形态和VEGF表达虽无明显变化,但肿瘤体积减小。研究结果表明低剂量ALA-PDT可通过刺激VEGF表达诱导照射区新生血管形成,这种微环境的改变有利于U87胶质瘤细胞生长,但这些作用可被贝伐单抗所抑制。     

肿瘤移植裸鼠粪类圆线虫感染病原和分子诊断

目的：肿瘤移植裸鼠粪类圆虫病诊断。方法肿瘤移植裸鼠的尸体解剖显微镜检查发现类圆线虫作形态学鉴定并采用二重PCR进行分子诊断。结果尸检发现肿瘤移植裸鼠样本中出现大量粪类圆线虫,初步确诊粪类圆线虫病,二重PCR检出样本中粪类圆线虫特定DNA进一步确诊。结论防止这种严重后果是早期诊断。肿瘤移植受体和供体应进行寄生虫感染包括类圆线虫病筛查。本研究第一个广泛报道了肿瘤移植裸鼠粪类圆虫病诊断。     

A novel gene delivery system targeting cells expressing VEGF receptors

Two ligand oligopeptides GV1 and GV2 were designed according to the putative binding region of VEGF to its receptors.GV1,GV2 and endosome releasing oligopeptide HA20 were conjugated with poly-L-lysine or protamine and the resulting conjugates could interact with DNA in a noncovalent bond to form a complex.Using pSV2-β-galactosidase as a reporter gene,it has been demonstrated that exogenous gene was transferred into bovine aortic arch-derived endothelial cells (ABAE) and human malignant melanoma cell lines (A375) in vitro.In vivo experiments,exogenous gene was transferred into tumor vascular endothelial cells and tumor cells of subcutaneously transplanted human colon cancer LOVO,human malignant melanoma A375 and human hepatoma graft in nude mice.This system could also target gene to intrahepatically transplanted human hepatoma injected via portal vein in nude mice.These results are correlated with the relevant receptors(flt-1,flk-1/KDR) expression on the targeted cells and tissues.     

3,5-二氯苯基双胍抑制黑色素瘤肺转移的裸鼠体内药效学研究

目的 确认整合素αvβ3新型抑制剂3,5-二氯苯基双胍对人黑色素瘤肺转移的抑制作用.方法 应用前期建立的人黑色素瘤裸鼠肺转移模型,观察3,5-二氯苯基双胍的治疗效果.裸鼠尾静脉接种黑色素瘤细胞(第1天)后,于第5、9、13、17和21天给予该药物治疗.50 d实验结束,处死裸鼠并取完整的肺组织,Bouin氏液固定24 h后根据肺表面癌结节的大小和数量给予评分,以此评价肺转移的程度.结果 3,5-二氯苯基双胍6、12 mg/kg和24 mg/kg治疗组的转移分数分别为(55.25±13.60)、(35.13±17.36)和(12.83±11.44),与溶剂对照组(转移分数是82.50±17.72)相比具有明显差异(P＜0.05).阳性对照组的转移分数为(11.50±10.44)(P＜0.05 vs 溶剂对照组),阴性对照组和PBS对照组的转移分数分别为(88.50±17.21)、和(88.87±11.29) (P ＞0.05 vs溶剂对照组).结论 3,5-二氯苯基双胍在裸鼠体内能够明显抑制黑色素瘤肺转移,并呈现一定的剂量依赖性.