乙型肝炎病毒X基因准种特点的研究

以乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｘ基因序列的异质性表现来探讨ＨＢＶ准种在　慢性感染者中的存在状态。以中国株ＨＢＶ基因序列为依据,设计特异性多聚酶链反应引物,　自９例慢性ＨＢＶ感染患者血清中扩增ＨＢＶ　Ｘ基因,克隆入ｐＧＥＭ　Ｔｅａｓｙ质粒,随机挑选克隆进行Ｄ　ＮＡ测序以确定病毒的变异程度。３７例测序结果提示来源于不同患者ＨＢＶ　Ｘ基因序列高度保守　,但每个序列均不一致。Ｘ区除了存在广泛的碱基点替换突变外,序列的缺失突变占测序克　隆总数的５１．４％（１９／３７）;氨基酸缺失及移框突变多发生于１２３位氨基酸残基之后,可导致Ｘ蛋　白多种羧基端形式。结果提示ＨＢＶ长期携带者体内有ＨＢＶ准种共存,Ｘ区内存在热点缺失突变区,该区突变结果可能影响Ｘ蛋白反式激活功能。     

乙型肝炎病毒X基因及HBx蛋白的研究进展

我国是乙型肝炎高发区,乙型肝炎病毒(HBV)X基因及其编码的多功能蛋白HBx是乙型肝炎病毒基因转录所必需的作用因子,在乙肝的致病过程中起到重要作用。HBx可直接或间接改变肝脏结构细胞的结构和功能,引发肝脏细胞的凋亡;具有广泛的非特异性反式激活作用,反式激活细胞内的某些癌基因或病毒基因,与乙型肝炎和肝细胞癌的发生关系十分密切。本文从多方面综述了X基因及HBx蛋白目前的研究进展,展现了X基因功能的多样性。     

乙型肝炎病毒X基因研究的新进展

本文对近３年有关乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｘ基因研究的国内外主要文献进行了综述,重点介绍了Ｘ蛋白的结构对其反式激活作用的影响、Ｘ蛋白与信号传导的关系、Ｘ蛋白对抑癌基因Ｐ５３和转化生长因子ＴＧＦ－β１功能的影响,以及Ｘ基因转基因小鼠模型的建立和反义核酸对该模型发展演进的阻抑作用。对Ｘ蛋白的组织、血清中的检测和相应单克隆抗体核素导向治疗也作了简要介绍。     

乙型肝炎病毒X蛋白(HBx):一种多功能的病毒调节因子

乙型肝炎病毒(HBV)的慢性感染是导致肝细胞癌(HCC)的主要危险因子。X蛋白(HBx)被认为在肝细胞癌的发生发展中起重要作用。X基因是HBV基因组最小的开放读码框,它编码的X蛋白含154个氨基酸,分子量约为16．5kD。HBx是一种多功能的病毒调节因子,通过调节细胞和病毒的转录活性、信号传导途径、基因毒性压力反应、蛋白质降解等,直接或间接地影响HBV的复制和增殖。HBx亦可影响细胞周期调控、细胞凋亡,从而可能在慢性活动性肝炎和肝硬化的病程中起到起始肿瘤形成的作用。     

乙型肝炎病毒X基因诱导的细胞基因表达与肝细胞肝癌

乙型肝炎病毒X基因与原发性肝癌的发生密切相关,其编码的蛋白质(HBxAg)具有的反式激活功能,可通过结合细胞核内的转录因子和改变细胞质内信号转导途径而激活宿主基因的转录及调控细胞凋亡等。研究发现,用HBx基因转染HepG2细胞,有10个细胞基因有表达差异,其中8个基因表达增强,2个基因表达减弱。已经证明,HBx诱发的这种高水平表达的细胞基因产物及其相应的抗体常存在于肝癌发生之前的乙型肝炎患者血清中,而且这些细胞蛋白及其相应抗体的出现早于甲胎蛋白几个月,甚至一年以上。提示,这些指标有可能用于原发性肝癌的筛查和早期诊断,成为原发性肝癌颈警、早期诊断和疗效评估的新指标。     

乙型肝炎病毒与肿瘤抑制基因p53相互作用的生物学功能及意义

以前的研究发现：ＨＢＶ Ｘ蛋白能与肿瘤抑制基因ｐ５３蛋白结合,在原发性肝癌的发生中具有重要意义。为进一步探讨二者之间的关系,经过计算机比较分析发现,在ＨＢＶ基因组中存在与经典的ｐ５３ＤＮＡ－蛋白质结合位点类似的序列（ＴＧＣＣＴ）,用含有此序列的ＨＢＶ基因片段作探针,与肝癌细胞核蛋白作用,通过凝胶电泳迁移率移位实验、凝胶电泳迁移率超移位实验和原位紫外线交联实验,确定其ＨＢＶ ＤＮＡ与ｐ５３蛋白的特异     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建含有天然完整的乙型肝炎病毒(HBV)X基因序列的真核表达载体,观察其在肝癌细胞株中的表达。方法:设计并合成HBV X基因的引物,用PCR方法从含完整HBV全基因的HepG2细胞中扩增X基因序列,并将其连接到真核表达载体pVAX-1上,酶切、PCR鉴定;用Triton X-114去除质粒内毒素后,采用电穿孔法将重组质粒pVAX-HBV X和空质粒pVAX-1分别转染SMMC-7721细胞,RT-PCR法检测HBV X基因mRNA的表达,Western印迹鉴定HBV X蛋白(HBx)的表达。结果:酶切和PCR鉴定证实pVAX-HBV X载体中包含完整的HBVX基因片段,该重组质粒转染的SMMC-7721细胞中HBV X基因mRNA及HBx蛋白的表达稳定。结论:构建了HBV X基因的真核表达载体,为X基因及其编码蛋白的生物学功能的研究提供了可靠的基因材料。     

乙型肝炎病毒逆转录酶区基因序列准种与变异特点

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)P基因编码产物从功能上分为末端蛋白(1～178aa)、间隔区(179～336aa)、逆转录酶区(337～682aa)和RNA酶H区(683～816aa),各区有相应的生物学功能;逆转录酶区包含S基因主蛋白编码区.近年来的研究提出HBV感染者体内存在有准种[1,2]的假说.我们以逆转录酶区序列为研究靶区域,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增慢性乙型肝炎患者血清中的靶基因序列,随机选择克隆测序,比较其结果,证明了HBV准种特点的存在,并发现多种基因突变形式.     

丙型肝炎病毒准种血清学检测技术的建立

目的:建立一种以血清学为基础的丙型肝炎病毒(HCV)准种检测技术。方法:自20份HCV血清中各挑选30个克隆进行测序比较,分析HCV准种的复杂程度;以HCV准种代表性抗原组合制备免疫芯片,用血清学检测技术分析上述20份HCV血清中的准种变异程度;比较两种方法之间的检出灵敏度和相关性。结果:测序法检出灵敏度为70.0%,血清学检测法检出灵敏度为95.0%,后者显著高于前者(P0.05);两种方法检测结果的相关性为74.7%(P0.01)。结论:血清学检测技术操作简单,且能够反映丙型肝炎患者的HCV准种变异程度,适于临床推广。     

丙型肝炎病毒准种在NS2区的变异状况初探

探讨HCV准种在NS2区的基因结构特征及变异状况。利用逆转录－巢式PCR从1份HCV慢性携带者的阳性血清及1份丙肝患者的血清中获得HCV NS2全长cDNA,将其克隆于T载体,各随机挑取5个阳性克隆进行序列测定,结果显示克隆到HCV NS2全长基因,所测克隆在核苷酸水平和氨基酸水平互不相同。该慢性携带者HCV NS2区序列以完整读码框架（ORF）为主,一个于HCV多聚蛋白第835位氨基酸的位置出现终止信号,而该丙型肝炎患者以NS2N端发现终止信号的序列为主,其中三个于第835位氨基酸的位置出现终止信号,一个于第887位氨基酸的位置出现终止信号,仅一个克隆的序列为完整ORF。对ORF完整的序列进行比较,发现丙型肝炎患者氨基酸变异主要集中于N端,蛋白二级结构模拟显示丙肝患者NS2与慢性携带者的优势二级结构类似,研究表明从我们选择的两种感染者的HCV NS2序列看,不同临床类型的HCV病人体内的HCV准种在NS2区存在差异,这种差异可能与病毒存在于机体的状态一定的一致性。     

丙型肝炎病毒准种在NS2区的变异状况初探

探讨HCV准种在NS2区的基因结构特征及变异状况.利用逆转录-巢式PCR从1份HCV慢性携带者的阳性血清及1份丙肝患者的血清中获得HCVNS2全长cDNA,将其克隆于T载体,各随机挑取5个阳性克隆进行序列测定.结果显示克隆到HCVNS2全长基因,所测克隆在核苷酸水平和氨基酸水平互不相同.该慢性携带者HCVNS2区序列以完整读码框架(ORF)为主,一个于HCV多聚蛋白第835位氨基酸的位置出现终止信号,而该丙型肝炎患者以NS2N端发现终止信号的序列为主,其中三个于第835位氨基酸的位置出现终止信号,一个于第887位氨基酸的位置出现终止信号,仅一个克隆的序列为完整ORF.对ORF完整的序列进行比较,发现丙型肝炎患者氨基酸变异主要集中于N端,蛋白二级结构模拟显示丙肝患者NS2与慢性携带者的优势二级结构类似.研究表明从我们选择的两例感染者的HCVNS2序列看,不同临床类型的HCV病人体内的HCV准种在NS2区存在差异,这种差异可能与病毒存在于机体的状态有一定的一致性.     

体外针对X基因的小干扰RNA的抗乙型肝炎病毒效应研究

目的：探讨体外针对乙型肝炎病毒（HBV）X基因的小干扰RNA（siRNA）对HBV复制和抗原表达的抵制作用。方法：利用siRNA表达框架法设计针对HBVX基因的siRNA,转染HepG2．2．15细胞,RT-PCR半定量检测转染前后X基因的表达;ELISA法测定各组24、48、72hHBsAg和HBeAg的含量;荧光定量PCR检测48h时HBVDNA的变化。结果：制备了HBVX基因的siRNA,转染后24、48和72h,HBVX基因mRNA的量分别减少了57％、78％和40％;siRNA能抑制HBsAg和HbeAg的分泌,抑制高峰在48h,抑制率分别为42％和43％;荧光定量PCR证实HBVDNA的复制亦受到抑制。结论：针对HBVX基因的siRNA在体外具有抑制HBV复制和抗原表达的作用。     

HBXIP基因对乙肝病毒X蛋白诱导细胞凋亡的影响

探讨乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白(hepatitisBXinteractingprotein ,HBXIP)基因在乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)诱导肝癌细胞凋亡时对细胞周期的影响.构建HBXIP基因真核表达载体pcDNA3 hbxip ,进行瞬时基因转染,将克隆有HBx基因的pCMV X (分别为1μg、2 μg和3μg)和pcDNA3 hbxip质粒分别和共转染至人H74 0 2肝癌细胞中(总体积分别为5 0 μl) .发现瞬时转染3μgpCMV X质粒后,肝癌细胞凋亡发生率为34 4 % ,肝癌细胞的细胞周期相关蛋白p2 7表达水平发生明显上调;与对照组相比,瞬时转染1μg、2 μg和3μg时,细胞周期蛋白D和细胞周期蛋白E的表达水平均发生明显上调,但随着HBX水平的增加细胞周期蛋白D和细胞周期蛋白E的表达水平发生明显下降;在稳定转染pCMV X质粒的H74 0 2 X肝癌细胞中无明显的细胞凋亡发生,研究发现p2 7的表达水平发生了明显下调,而细胞周期蛋白D和细胞周期蛋白E的表达水平发生了明显上调;当pcDNA3 hbxip质粒与pCMV X质粒进行共瞬时转染时,细胞凋亡发生率由pcDNA3质粒与pCMV X质粒共转染时的2 9 2 %下降为13 3% ,p2 7的表达水平发生了下调,但细胞周期蛋白D和细胞周期蛋白E的表达水平无明显变化.研究结果表明,瞬时转染一定剂量的x基因可导致肝癌细胞发生凋亡,细胞周期相关蛋白p2 7、细胞周期蛋白D和