苹果6-磷酸山梨醇脱氢酶基因启动子逆境诱导表达特性研究

为研究6-磷酸山梨醇脱氢酶(sorbitol-6-phosphate dehydrogenase,S6PDH)基因启动子(S6PDHp)的逆境诱导表达特性,利用Gateway技术构建了S6PDH基因启动子区5'端系列缺失体与GUS基因的融合表达载体,并通过农杆菌介导法转化拟南芥。对转基因拟南芥进行低温和外源ABA处理,通过GUS蛋白活性变化分析S6PDHp的逆境诱导表达特性。研究结果发现,通过Gateway技术构建了4个S6PDHp 5'端系列缺失体与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的融合表达载体(pGWB433-S6PDHp1、pGWB433-S6PDHp2、pGWB433-S6PDHp3和p GWB433-S6PDHp4)并获得了相应的转基因拟南芥。对转基因植株进行低温处理后发现,p GWB433-S6PDHp3转基因植株中的GUS活性增幅最大,达到显著水平,而其他转基因植株中的GUS活性基本保持不变。外源ABA处理后发现,除p GWB433-S6PDHp4外,其余启动子缺失体转基因拟南芥中GUS活性显著升高。以上结果表明,低温和外源ABA能够诱导S6PDHp的表达,但不同的缺失体响应程度不同,意味着在S6PDHp序列(-2 396bp至-236bp)中可能存在着响应逆境胁迫的正负调控顺式作用元件。     

抗逆基因AtRPK1启动子关键顺式作用元件的研究

为确定拟南芥抗逆相关基因AtRPK1启动子的顺式功能元件,对其启动子区进行了分段克隆。通过5'端缺失方法得到203、316、604、809 bp 4个启动子片段,分别构建成p1300-pro-GUS表达载体,并转入拟南芥,进行GUS染色和GUS定量检测。通过对809 bp全长启动子转基因拟南芥GUS染色发现,转基因拟南芥的叶片、茎、花、根中均有表达,在分生能力强的组织和维管束集中的组织,AtRPK1基因启动子具有较高启动表达能力。5'端缺失启动子检测结果表明,转录起始点到启动子上游-114位点区域包含AtRPK1基因启动子的关键顺式作用元件。对启动子缺失片段转基因植株利用200 mmol·L-1NaCl胁迫3 h后,β-葡萄糖苷酸酶活力定量检测结果表明,在启动子上游-19位点处的GT-1顺式作用元件GAAAAA可能直接与盐胁迫应答相关。     

荔枝LcVSP1基因5''调控序列的克隆及功能初步鉴定

利用Genome walker法获得了荔枝营养贮藏蛋白质LcVSP1基因的5'调控序列,构建了含有该序列的植物表达载体并转化烟草,通过PCR和GUS染色对转化植株进行了鉴定.序列分析表明,LcVSP1基因的5'调控序列中除含有真核生物典型的核心启动子区域和保守的TATA box序列外,还发现了一些与真核生物启动子中相似的顺式调控元件.对获得的转基因植株的GUS染色发现,在转基因植株的茎、叶柄和主叶脉呈现蓝色,表明LeVSP1的5'调控序列可以启动GUS基因的表达,具有启动子的活性,并具有组织特异性.     

拟南芥色氨酸生物合成途径中PAI基因编码区5'端序列对基因表达的影响

将3个非等位PAI基因的启动子与其编码区5'端序列及GUS报告基因拼接成表达质粒,并转化拟南芥.GUS活性分析表明,PAI基因编码区5'端序列对维持PAI启动子所驱动的GUS活性是必须的, 有无该序列对GUS活性影响极大,在PAI1和PAI3中相差60～100倍, PAI2中相差1倍左右.GUS组织化学定位有相似结果,具5'端序列时,PAI启动子所驱动的GUS在植株的不同组织器官中有不同程度的表达,在叶片的叶肉细胞、保卫细胞中表达, 但在无叶绿体的表皮细胞中不表达.因此认为PAI基因的5'端片段所编码的多肽确有PTP的功能,PAI基因产物主要在质体(叶绿体)中表现出活性.     

拟南芥生长素受体基因TIR1启动子的初步分析

以野生型拟南芥（Arabidopsis Columbia）基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到拟南芥生长素受体基因T1R1启动子的5个不同长度的系列缺失片段,将这些片断分别克隆到PGM—T载体上。序列分析表明,该启动子系列缺失片段的大小分别为2008bp、1524bp、939bp、532bp和321bp。与已报道的序列完全相同。将不同长度的启动子克隆片断分别与GUS基因融合,构建成表达载体后,在烟草叶片中作遗传转化。分析结果显示：不同长度的启动子片段已整合到烟草基因组中并有GUS酶活性存在,且不同长度启动子片段的表达活性有较明显差异。     

拟南芥鼠李糖合成酶基因AtRHM1启动子区葡萄糖应答调控元件的鉴定

植物中,UDP-L-鼠李糖是细胞壁骨架的主要成分,由鼠李糖合成酶催化底物UDP-α<,-D->葡萄糖合成.本实验从拟南芥基因组中分离了鼠李糖合成酶基因AtRHM1 1058bp的启动子序列并对启动子5'端进行了不同长度的缺失.将全长启动子及不同缺失启动子与GUS报告基因进行融合后转化野生型拟南芥,获得了一系列转基因植株.启动子缺失分析结果表明,AtRHM1基因在转录水平上受葡萄糖的诱导,参与葡萄糖应答反应的顺式调控元件位于启动子的-931 bp～-752bp区域.     

芥菜型油菜BjuA09DFR基因及其启动子的克隆与转化和表达

该研究利用实时荧光定量(qRT-PCR)检测了BjuA09 DFR基因的时空表达特异性,并通过克隆BjuA09 DFR基因启动子片段,构建该基因的启动子GUS融合表达载体,利用农杆菌介导法将重组质粒转入野生型拟南芥,最后对拟南芥转基因材料不同发育时期的不同组织部位进行GUS组织化学染色,分析BjuA09 DFR基因启动子的表达模式,为BjuA09 DFR基因启动子功能的进一步研究提供理论依据。结果表明:(1)BjuA09 DFR基因在芥菜型油菜的多个组织部位都有表达,尤其是在叶、花、角果和授粉后15d种子中表达量较高。(2)成功构建了BjuA09 DFR基因启动子和GUS基因融合表达载体(pBjuA09 DFR∷GUS),采用农杆菌介导法将重组质粒转入野生型拟南芥,经卡那霉素筛选和PCR检测抗性苗,获得转基因拟南芥阳性苗。(3)GUS组织化学分析结果显示,转基因拟南芥材料的GUS活性具有明显的时空特异性,在叶、花、角果和种子中的染色较深,具有很强的GUS活性。     

甘蔗UGPase5'侧翼序列克隆及缺失表达分析

以甘蔗(FN95;-1702)为材料,通过接头连接PCR方法克隆该基因不同长度5'侧翼序列。将不同长度的5'侧翼序列连同UGPase基因的外显子片段定向插入到GUS基因上游,在保证其后GUS编码框不发生偏移的情况下,插入的UGPase外显子融合GUS表达成为新的报告基因。根据此策略,构建了一系列表达结构为5'Flanking Sequence-UGPase Exon-GUS-Nos polyA的5'侧翼序列缺失表达载体,进行启动子活性分析。注射法转染烟草叶片组织检测GUS瞬时表达,分析结果表明,所克隆到的UGPase基因5'端侧翼序列不具有启动子活性。     

中间锦鸡儿CiNAC038启动子的克隆及对激素响应分析

NAC转录因子家族是植物中特有的、家族数目较多的一类转录因子家族,对植物生长发育起重要作用。了解CiNAC038的表达调控分子机制,为中间锦鸡儿CiNAC038功能研究奠定基础。以中间锦鸡儿为植物材料,通过染色体步移法克隆启动子序列,并对启动子序列上的响应元件进行分析。构建GUS表达载体,并转化拟南芥,对拟南芥的组织特异性进行表达分析,用ABA诱导转基因植株,研究ABA与CiNAC038的关系。结果显示,克隆了1 800 bp的CiNAC038启动子序列,该启动子包含多种顺式元件。成功构建植物表达载体ProCiNAC038∶GUS,通过浸花法转化至野生型拟南芥。GUS组织化学染色结果显示,转基因拟南芥幼苗根部染色较深,胚轴无染色;成熟期转基因拟南芥的叶脉、果荚两端、花瓣、花药等组织染色较深,茎无染色。CiNAC038启动子驱动的GUS报告基因主要在植物叶片、根和花的组织器官表达。进一步ABA诱导表达分析发现,GUS染色随着浓度增加颜色越浅。CiNAC038启动子是ABA抑制型启动子。     

拟南芥AtNCED2基因启动子区域序列克隆及其活性分析

目的:克隆拟南芥AtNCED2基因启动子区域序列,并分析其组织器官特异性及对外界刺激的响应.方法:通过PCR从拟南芥基因组中克隆AtNCED2基因5'侧翼2295bp启动子区域序列(AtNCED2p),并进行生物信息学分析.构建AtNCED2p驱动GUS的植物双元表达载体pAtNCED2p::GUS,通过根癌农杆菌介导法将其转化野生型拟南芥,检测转基因植侏中GUS表达的组织器官特异性.结果:该启动子序列中存在TATA-box、CAAT-box、根器官特异性元件、ABA响应元件、低温响应元件、昼夜节律响应元件等顺式作用元件.GUS活性主要集中在转基因拟南芥根尖及侧根发生部位.外源ABA处理的转基因植株根中GUS活性为174.8nmol 4-MU min-1 mg-1蛋白,明显高于对照值91.7nmol 4-MU min-1mg-1蛋白.结论:AtNCED2基因可能在根的生长和发育中起作用,且外源ABA处理增强其在根中的表达.