酶的分子定向进化及其应用

酶的分子定向进化是20世纪90年代初兴起的一种蛋白质工程的新策略,是一种在生物体外模拟自然进化过程的、具有一定目的性的快速改造蛋A质的方法.该方法引起了生物催化技术领域的又一次革命.目前分子定向进化技术已被广泛应用于工业、农业及制药业等的相关领域.本文详细综述了酶的分子定向进化的概念、过程、基本策略及其核心技术,并着重介绍了酶的分子定向进化技术在提高酶的活力、稳定性、底物特异性和对映体选择性等几方面的应用及取得的相关成果.     

酶分子体外定向进化的研究进展

分子体外定向进化是改造酶分子的新策略,它主要通过体外模拟自然进化机制,利用基因随机突变、重组和定向筛选技术,使进化过程朝着人们需要的方向发展。简要介绍了酶分子体外定向进化的发展历史,详细介绍了突变文库构建和筛选方法的最新研究进展及应用情况。     

蛋白质定向进化技术的研究进展

蛋白质定向进化技术是蛋白质分子改造的一个重要策略.重点介绍了易错PCR、DNA改组等对编码蛋白质的基因进行随机突变和重组的技术,以及构建突变体库和高通量筛选的方法,并探讨了定向进化技术在蛋白质工程中的应用及前景.     

改进酶稳定性的定向进化技术

酶作为一种生物催化剂,以其独特的优良特性,在绿色化学和清洁生产中得到了广泛的应用。随着酶定向进化技术的建立和发展,通过定向进化改进酶稳定性的研究越来越多。详细综述了各种定向进化方法的特点及在提高酶稳定性方面的应用,并从结构和功能的角度进一步解释了相关机理。     

酶的定向进化及其应用

综述了生物催化剂（酶）分子定向进化的产生、原理、方法及应用,深入阐述酶分子定向进化过程中的相关问题,重点介绍了易错PCR（Error-prone PCR）和DNA改组（DNA shuffling）等几种典型的酶定向进化方法与成功实例,展望了生物定向进化研究的发展前景。     

蛋白质定向进化的研究进展

在工业生物催化过程和生物细胞工厂构建方面,蛋白质定向进化被广泛地应用于酶的分子改造.蛋白质定向进化不仅可以针对某一目的蛋白进行改造,还可以改善代谢途径、优化代谢网络、获得期望表型细胞.为了获得更高效的突变效率,快捷、高通量的筛选方法,提高蛋白质定向进化的效果,研究者不断开发蛋白质体内、体外进化方法,取得了新的进展和应用.本文介绍了最近发展的蛋白质定向进化技术的原理、方法及特点,总结了突变文库的筛选方法和蛋白质定向进化的最新应用,最后讨论了蛋白质定向进化存在的挑战和未来发展方向.     

体内连续定向进化研究进展

定向进化为合成生物学的发展提供了一种简单高效的工具,尤其在化学品合成和医药开发方面发挥着重要的作用。但是传统的定向进化技术存在操作繁琐、耗时和效率低的问题,不能满足大量突变文库的构建和筛选。近几年,一项将突变、翻译(进化非基因)、筛选和复制过程进行无缝连接的体内连续定向进化技术开始出现,该技术在噬菌体、细菌和真核细胞中均取得了突破性进展,极大地促进了定向进化技术的革新和应用。随着体内连续定向进化技术的不断发展,筛选方法和设备也不断改善。对体内连续定向进化技术、筛选方法和设备最新研究进展作一综述,并讨论当前面临的挑战和机遇。     

极端酶的研究进展

极端酶具有超常的生物学稳定性,能够在极端温度、pH、压力和离子强度下表现出生物学活性,因此极端酶为生物催化和生物转化提供了良机.新的极端物种的发现、基因组序列的确定及基因工程技术的应用,加快了发现和制备新酶的进程.蛋白质工程和定向进化技术进一步改善酶的活性和特异性,促进了极端酶的工业应用.对极端酶的研究加深了人们对酶稳定性机制的理解,丰富了分子进化理论.     

启动子和细胞全局转录机制的定向进化在微生物代谢工程中的应用

通过随机突变和定向选择而进行的定向进化(又称分子进化或人工进化)在改造酶的催化特性和稳定性、扩展酶的底物范围等方面具有广泛的应用。近年来,定向进化也开始应用在对结构基因的启动子区域和具有调节功能的蛋白如转录因子等进行代谢工程改造,并成功选育了对环境胁迫因素具有较强耐受性,以及发酵效率提高的微生物菌种。以下着重介绍近年来启动子的定向进化,包括启动子的强度和调节功能的分子进化,以及细胞全局转录工程等技术在微生物代谢工程中的应用,这些定向进化技术使人们可以更精细地调节基因表达水平,并可同时改变细胞内多个基因的转录水平,是代谢工程研究新的有力工具。     

合成生物学技术在材料科学中的应用

材料是人类赖以生存与发展的物质基础,科技和社会的进步都离不开材料技术的发展,未来先进材料的合成和制备必然朝着绿色可持续、低耗高产出、精细可调控、高效多功能的方向发展。以"基因调控·工程设计"为核心的合成生物学技术从分子、细胞层面极大地推动了生命科学的发展,也已经并继续为材料科学的发展注入新的思路和活力。本文将围绕合成生物学技术在材料科学中的应用,以基因回路设计为核心,概念应用为线索,重点介绍合成生物学技术在高分子生物材料和无机纳米材料领域的开发和生产,细胞展示和蛋白定向进化战略对分子材料的筛选和优化,"活体"功能材料、工程菌调节的人工光合系统功能材料体系以及基因回路在材料科学中的应用。     

DNA重排及体外分子进化

ＤＮＡ重排是目前为止最简便、最有效的体外定向进化技术,可以对单一基因、质粒、代谢途径、部分甚至整个基因组进行改造。本综述了ＤＮＡ重排的基本原理、特点、与其它体外进化技术的不同,着重介绍了其在体外分子进化上的广泛应用,并对应用前景进行了展望。     

Directed evolution and the creation of enantioselective biocatalysts

Directed evolution has emerged as a key technology to generate enzymes with new or improved properties that are of major importance to the biotechnology industry. A directed evolution approach starts with the identification of a target enzyme to be optimized and the cloning of the corresponding gene. An efficient expression system is needed before the target gene is subjected to random mutagenesis and/or in vitro recombination, thereby creating molecular diversity. Subsequently, improved enzyme variants are identified, preferably after being secreted into culture medium, by screening or selection for the desired property. The genes encoding the improved enzymes are then used to parent the next round of directed evolution. Enantioselectivity is a biocatalyst property of major biotechnological importance that is, however, difficult to deal with. We discuss recent examples of creating enantioselective biocatalysts by directed evolution.     

Advances in directed molecular evolution of reporter genes

Many reporter genes, such as gfp, gusA, and lacZ, are widely used for research into plants, animals, and microorganisms. Reporter genes, which offer high levels of sensitivity and convenience of detection, have been utilized in transgenic technology, promoter analysis, drug screening, and other areas. Directed molecular evolution is a powerful molecular tool for the creation of designer proteins for industrial and research applications, including studies of protein structure and function. Directed molecular evolution is based mainly on in vitro recombination methods, such as error-prone PCR and DNA shuffling. The strategies of directed evolution of enzyme biocatalysts have been the subject of several recent reviews. Here, we briefly summarize successes in the field of directed molecular evolution of reporter genes and discuss some of the applications.     

Advances in directed molecular evolution of reporter genes

Many reporter genes, such as gfp, gusA, and lacZ, are widely used for research into plants, animals, and microorganisms. Reporter genes, which offer high levels of sensitivity and convenience of detection, have been utilized in transgenic technology, promoter analysis, drug screening, and other areas. Directed molecular evolution is a powerful molecular tool for the creation of designer proteins for industrial and research applications, including studies of protein structure and function. Directed molecular evolution is based mainly on in vitro recombination methods, such as error-prone PCR and DNA shuffling. The strategies of directed evolution of enzyme biocatalysts have been the subject of several recent reviews. Here, we briefly summarize successes in the field of directed molecular evolution of reporter genes and discuss some of the applications.     

酶的分子设计、改造与工程应用

酶工程的研究已经发展到分子水平 ,在体外通过基因工程、化学、物理等手段改造酶分子结构与功能 ,大幅提高了酶分子的进化效率和催化效率 ,生产有价值的非天然酶。对酶工程学若干“热点”和前沿课题的研究、应用进行了概述 ,分析了国际上酶工程研究及应用技术、手段、方法 ,包括体外分子进化、核酶和抗体酶的设计、酶分子的定向固定化技术、酶蛋白分子的化学修饰、融合酶、人工合成及模拟酶等技术 ,并展望了酶工程的技术进步和应用的新进展。     

DNA shuffling技术及其在基因工程疫苗中的应用

DNA shuffling技术是一项全新的体外人工进化模式,它通过基因在分子水平上的重组,再定向筛选具有预期性状的突变体,获得同时具有多个亲本基因的特征的突变基因。该文介绍DNA shuffling技术的基本原理,并列举了由该技术发展而来的新技术及其在基因工程疫苗领域的应用,展望了DNAshuffling技术的发展方向。     

人工合成多样性突变文库研究进展*

突变文库的构建是定向进化研究过程中一个关键步骤,主要利用天然存在的系统或者人工合成的分子技术来产生多样性核酸分子文库,为制备和筛选具有一定特性的蛋白酶、多肽、人工抗体等提供庞大的遗传基因库,也可用于合成生物学中相关基因元件的研究与筛选,为目标生物制品的高效工业化生产提供动力。随着对突变文库构建技术研究的日益深入,各种文库构建策略相继被开发出来,并在生物能源、生物化工、生物医药、生物试剂和食品工业等方面得到了广泛的应用。然而,定向进化中的文库构建策略多有不同,各种突变文库构建技术的核心方法也在不断创新。主要介绍近年来实验室中人工合成多样性文库的前沿技术,并对文库构建技术在自动化和智能化方向的发展进行了展望。     

Directed Evolution of a Fluorogen-Activating Single Chain Antibody for Function and Enhanced Brightness in the Cytoplasm

Directed evolution is an exceptionally powerful tool that uses random mutant library generation and screening techniques to engineer or optimize functions of proteins. One class of proteins for which this process is particularly effective is antibodies, where properties such as antigen specificity and affinity can be selected to yield molecules with improved efficacy as molecular labels or in potential therapeutics. Typical antibody structure includes disulfide bonds that are required for stability and proper folding of the domains. However, these bonds are unable to form in the reducing environment of the cytoplasm, stymieing the effectiveness of optimized antibodies in many research applications. We have removed disulfide-forming cysteine residues in a single chain antibody fluorogen-activating protein (FAP), HL4, and employed directed evolution to select a derivative that is capable of activity in the cytoplasm. A subsequent round of directed evolution was targeted at increasing the overall brightness of the fluoromodule (FAP–fluorogen complex). Ultimately, this approach produced a novel FAP that exhibits strong activation of its cognate fluorogen in the reducing environment of the cytoplasm, significantly expanding the range of applications for which fluoromodule technology can be utilized.