神经节苷脂GM_3对人白血病J6-2细胞PKC转位及DAG含量的影响

应用SDS PAGE及Western印迹技术检测神经节苷脂GM3 处理前后人白血病J6 2细胞不同类型PKC在细胞内的转位情况 ,同时利用高效薄板层析技术观察了细胞内DAG含量的变化 ,从而探讨GM3 抑制PKC活性的机制 .实验发现 ,GM3 处理后胞液PKCα明显增加 ,而颗粒结合PKCα则相对减少 ;GM3 对其它亚型PKC在细胞内分布无显著影响 .同时还发现 ,GM3 处理后细胞内DAG含量降低 (P <0 0 5 ) .结果表明 ,GM3 抑制PKCα由胞浆向质膜转位 ,对其它亚型PKC在细胞内转位无影响 .提示GM3 抑制的PKC亚型可能是PKCα .同时GM3 降低细胞内DAG含量 ,这可能与GM3抑制PKCα活性机制有关     

BcL2蛋白质家族——定位与转位

Bcl-2蛋白质家族的抗凋亡和促凋亡成员,在线粒体水平上决定细胞的存活或死亡.在正常细胞中,这些成员呈现功能适应性的细胞内分布;抗凋亡成员主要定位于细胞内膜系特别是线粒体外膜上：但绝大多数促凋亡成员主要分布于细胞浆中.细胞接受死亡信号后,Bcl-2家族成员本身受到一系列的调节,如磷酸化、裂解、蛋白质-蛋白质相互作用等,结果之一是促凋亡成员发生细胞内定位的改变,从细胞浆转位于线粒体膜上,并引发线粒体功能异常及其内外膜间致凋亡因子的释放,最终导致细胞凋亡.     

BMF促细胞凋亡研究进展

BMF(Bcl-2-modifying factor)是一种具有促凋亡作用的Bcl-2家族成员.在正常生理状态下,内源性的BMF持续锚定在胞浆中的细胞骨架上,时刻感受细胞内的变化.一旦损伤刺激作用于细胞,BMF从胞浆转移至线粒体,触发线粒体凋亡途径,造成细胞损伤.BMF的促凋亡作用受到转录、翻译和翻译后修饰的调控,过表达或者转录上调的BMF主要定位于线粒体,诱导细胞凋亡.由此可见,BMF具有强大的促凋亡功能.     

去极化时Ca~(2+) 内流引起蛋白激酶C_α浆膜转位

 为观察胞外Ca2 + 内流和肌浆网Ca2 + 释放两种来源的Ca2 + 对cPKCα转位激活的影响 ,揭示PKC在去极化 nAChR转录偶联中的作用 ,构建了pPKCα EGFP N1融合蛋白真核基因表达载体 .转染C2C1 2肌细胞后 ,采用激光共聚焦显微镜记录了KC1或咖啡因处理所引起的细胞Ca2 + 波变化及PKCα GFP融合蛋白在细胞内的分布 .结果提示 ,只有用KC1处理引起细胞膜去极化时 ,伴随Ca2 +内流 ,才能观察到PKCα GFP绿色荧光在细胞内发生的细胞浆至细胞膜分布变化 .然而 ,采用肌浆网Ca2 + 通道激动剂咖啡因刺激肌细胞 ,使肌浆网中Ca2 + 释放 ,未见PKCα GFP绿色荧光在浆、膜分布发生任何变化 .结果提示 ,去极化时外Ca2 + 内流可引起PKCα转位激活 ,肌浆网Ca2 + 释放对PKCα的转位激活没有影响 .     

PKC对小鼠受精卵发育的调控作用

为研究 TPA及 PKC的反义寡核苷酸对 1 -细胞期鼠受精卵发育的影响 ,采用免疫细胞化学法标记 PKC(α及 β亚型 ) ,并用激光扫描共聚焦显微镜测定卵内 PKC荧光强度 ;同时利用显微注射法注射 PKC的反义寡核苷酸 ,观察其对受精卵分裂的影响 . 1 0 0 μg/ L TPA对 1 -细胞期受精卵的发育具有完全抑制作用 .TPA处理 1 2 h后 ,对照组受精卵停留在 1 -细胞期 ,而未经 TPA处理的1 -细胞期卵可以分裂到 2 -细胞期 .共焦激光显示实验组与对照组相比 ,PKC(α、β亚型 )荧光强度均有下降 (P<0 .0 1 ) .显微注射 PKC antisenseα及 antisenseβ的受精卵 ,分别只有 1 4 .2 %和 3.33%的卵可以发育到 2 -细胞期 .与对照组 (注射 M2培养液 )差异显著 (P<0 .0 1 ) .结果表明 ,(1 ) TPA长期处理 1 -细胞期受精卵 ,抑制 1 -细胞期卵分裂到 2 -细胞期 ;(2 ) PKC的反义寡核苷酸 (α及β亚型 )可以抑制小鼠 1 -细胞期卵的发育     

缺氧诱导心肌细胞凋亡与Caspase-3激活及细胞内钙超载的关系

目的: 研究缺氧对心肌细胞Caspases的激活效应与细胞内钙的关系.方法: 将培养的心肌细胞暴露于95% N2/5% CO2混合气体培养室进行缺氧处理,缺氧0、30 min、1、3、6、12、24 h后,应用激光共聚焦显微镜检测缺氧早期心肌细胞胞浆游离钙的变化;应用细胞内钙螯合剂、Caspase-1与Caspase-3特异性抑制剂预处理心肌细胞后缺氧12 h,检测DNA片段化与Caspase-3活性;Western blot、RT-PCR方法分别检测细胞线粒体与胞浆中Cyt c蛋白的变化以及Caspase-3 mRNA表达的改变.结果: 缺氧后30 min心肌细胞胞浆游离钙即显著增高,1 h达到峰值.缺氧3 h线粒体Cyt c无显著变化,而胞浆中Cyt c开始增多,至缺氧12 h,线粒体中Cyt c仅见一弱阳性条带,而胞浆呈强阳性反应,缺氧24 h 线粒体中已不能检测到Cyt c.缺氧3 h心肌细胞Caspase-3 mRNA上调,在观察的24 h内持续处于高表达状态.分别应用Caspase-3抑制剂和细胞内钙螯合剂预处理心肌细胞后均可使心肌细胞Caspase-3活性降低并完全阻断DNA片段化发生,细胞内钙螯合剂与Caspase-3抑制剂联合应用使凋亡细胞百分率降低的程度比分别单独使用两者更明显.结论: 缺氧可致心肌细胞线粒体Cyt c释放至胞浆,导致Caspase途径激活,从而导致细胞凋亡.缺氧所致心肌细胞钙超载在时序上早于线粒体Cyt c释放与Caspase-3的激活,螯合细胞内钙可阻断缺氧诱导的Caspase-3激活,并拮抗心肌细胞凋亡的发生,因此细胞钙超载是启动线粒体Cyt c释放与Caspase-3激活的一个早期重要分子事件.     

佛波酯(TPA)促进NIH3T3细胞α5β1整合蛋白的合成

佛波酯(TPA)是潜在促肿瘤剂,也是蛋白激酶PKC激活剂.TPA能在极低浓度下替代DG激活PKC,从而导致一系列细胞功能变化.应用100nmol/LTPA作用于NIH3T3细胞,观察NIH3T3细胞的粘附变化,发现TPA可促进NIH3T3细胞与基质纤连蛋白的粘附,进一步研究Fn的主要受体α5β1整合蛋白在细胞表面含量,发现TPA作用24h使α5及β1含量分别增加523%和516%.应用3H甘露糖标记N糖链和凝集素柱层析方法分析TPA作用后细胞N糖链总量和组分比,结果均与对照组相仿,说明是通过增加细胞合成整合蛋白α5及β1亚基含量实现的.在TPA作用于细胞的同时,加入PKC抑制剂Sphingosine,发现α5、β1含量和细胞与Fn的粘附均回复至对照组水平,提示TPA增加α5β1整合蛋白合成而增加的细胞与Fn粘附作用,是由PKC介导完成的.此外还发现酪氨酸蛋白激酶抑制剂也阻断TPA增加α5β1整合蛋白含量的作用.     

姜黄素诱导人成骨肉瘤MG-63细胞凋亡过程中hnRNP A2/B1表达与定位

姜黄素(curcumin)诱导处理的人成骨肉瘤MG-63细胞,在光镜和电镜观察细胞凋亡的基础上,对hnRNP A2/B1在核基质中存在、分布及其与凋亡相关基因产物在MG-63细胞中的共定位关系进行了研究.经姜黄素处理后,细胞出现染色质凝聚、细胞核固缩、凋亡小体等典型的细胞凋亡形态特征;双向凝胶电泳和质谱鉴定结果显示,hnRNP A2/B1存在于MG-63细胞核基质蛋白组分中,在姜黄素处理后细胞核基质蛋白中表达下调.蛋白质印迹杂交结果,证实hnRNP A2/B1在姜黄素处理前后的MG-63细胞核基质蛋白中的存在及其表达下调变化.免疫荧光显微镜观察显示,hnRNP A2/B1定位于MG-63细胞核基质纤维上,经姜黄素处理后出现分布位置与表达水平变化.激光扫描共聚焦显微镜的观察结果显示,hnRNP A2/B1在MG-63细胞凋亡过程中与Bax、Bcl-2、Fas和p53等基因产物具有共定位关系,且其共定位区域发生了变化.研究结果证实了hnRNP A2/B1定位于核基质纤维上,是一种核基质蛋白,在姜黄素诱导人成骨肉瘤MG-63凋亡过程中的表达与分布变化及其与凋亡相关基因的关系显然对MG-63细胞凋亡具有重要影响,这为深入揭示肿瘤细胞凋亡的机制提供了重要科学依据和深入探索的新方向.     

细胞周期蛋白依赖激酶Roscovitine 诱导非小细胞肺癌A549 细胞凋亡及 其机制的研究

目的:探讨细胞周期蛋白依赖激酶(CDK)抑制剂Roscovitine(Ros)诱导非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞凋亡及其作用机制。方法:以不同浓度Ros(10μM、20μM、40μM)处理细胞24h,采用Annexin V-PI染色以流式细胞仪检测细胞凋亡,Westernblot法检测胞浆中和线粒体促凋亡蛋白Bax和Bad的表达,流式细胞仪检测线粒体膜电位(MMP)变化。结果:Ros以剂量依赖的方式诱导A549细胞凋亡,同时Bad和Bax在胞浆的含量随着Ros剂量的增加而减少,而在线粒体中却出现相反的结果,线粒体膜电位随Ros剂量的增大而降低。结论:Ros可通过促进Bax和Bad由胞浆向线粒体易位,诱导NSCLC A549细胞由线粒体途径发生凋亡。     

细胞凋亡中的核/质转运

核/质转运和细胞凋亡是两种截然不同的细胞内过程,它们是密切相关的.在细胞凋亡过程中,细胞核的凋亡损伤伴随着多种多样的促凋亡因子在细胞质澈活并进入细胞核.DNA损伤产生的死亡信号也需要传递到细胞的各个部位,来确保细胞死亡的协调执行.因此,凋亡信号的核,质穿梭是细胞凋亡不可或缺的一部分.