禾谷缢管蚜体内的病毒结合蛋白基因的克隆与原核表达

利用一对特异性引物,用PCR的方法从禾谷缢管蚜体内扩增出了病毒结合蛋白基因,序列测定结果表明其长度 为1647 bp,编码548个氨基酸,与GenBank中的禾谷缢管蚜美国生物型Buchnera groELNT核苷酸序列同源性为97%,氨基酸同源性为97.4%。构建了2个原核表达载体并进行表达得到了69kD融合蛋白和63kD的非融合蛋白。     

番茄花叶病毒外壳蛋白基因及3′端非编码区的克隆、序列分析及其表达

根据已报道的番茄花叶病毒Ｌ株系（ＴｏＭＶＬ）序列人工合成引物,经ＲＴＰＣＲ扩增并克隆了我国番茄花叶病毒分离物（ＴｏＭＶＳ１）的外壳蛋白ＣＰ基因及３′端非编码区。序列测定结果表明,所得ｃＤＮＡ共长６８２个核苷酸,其中ＣＰ基因含４８０个核苷酸,编码１５８个氨基酸,３′端非编码区含２０２个核苷酸,其核苷酸序列与ＴｏＭＶＬ株系具有９９．５％的同源率。将该基因片段克隆到ｐＧＥＭＥＸ１载体中,转入Ｅ．ｃｏｌｉ后诱导表达,经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测证明,该基因已在大肠杆菌中正确表达。这是我国首次报道ＴｏＭＶＣＰ基因序列。     

烟草环斑病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清的制备

烟草环斑病毒(Tobaccoringspotvirus,TRSV)是我国二类进境检疫危险性有害生物,对农业生产危害较大。本研究依据TRSV外壳蛋白基因cp序列设计合成了2条引物,通过RT-PCR扩增得到长约1500bp的目的片段。将目的片段与质粒pET-22b( )连接,构建了含TRSVcp基因的融合蛋白原核表达载体pETRSV-CP。序列分析表明,TRSV-SD1的cp基因全长1548bp,编码515个氨基酸与GenBank中其它TRSV分离物cp基因相比,核苷酸及推导的氨基酸序列同源性为90.7%~94.6%。将pETRSV-CP转入大肠杆菌,诱导表达。SDS-PAGE结果显示,表达的TRSVCP融合蛋白的相对分子质量约为58kDa。以此融合蛋白制备的抗血清的效价为1/1024,抗血清与TRSV具有良好的特异性反应。     

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-3融合蛋白的表达研究

利用PCR扩增得到粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-3(IL-3)完整基因片段,将其分别克隆至pGEM-T,构建成GMCSF/IL-3融合蛋白基因,DNA序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆至T7RNA聚合酶表达载体pT7zz,得到表达质粒pFu,经转化至表达宿主E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经SDS-PAGE电泳鉴定扫描分析,目的基因产物表达量占菌体总蛋白量的30%以上,目的基因表达产物以包涵体的形式表达。Westernblot鉴定表明,该表达产物可以与GM-CSF抗体及IL-3抗体特异性结合。目的基因表达产物经过包涵体变性、透析复性及柱层析纯化,用GM-CSF、IL-3依赖细胞株TF-1检测,具有明显的生物学活性。     

幽门螺杆菌热休克蛋白70基因的克隆与表达

从幽门螺杆菌染色体ＤＮＡ,用ＰＣＲ方法扩增得到了热休克蛋白７０基因。序列分析表明,我国Ｈｐ临床分离株Ｙ２的热休克蛋白７０基因与经全基因组序列测定的两株幽门螺杆菌２６６９５和ｊ９９有高度同源性。将该基因克性到融合分泌表达载体ｐＭＡＬ－ｐ２中,转化大肠杆菌,在ＩＰＴＧ诱导下表达出与预期大小相符的１１３ｋＤ的融合表达蛋白。该蛋白质３０℃诱导表达５ｈ后,可达到细菌周质总蛋白质的１９．４％。用免疫印迹分析表     

大鼠CRIP2蛋白的表达和分离纯化

目的:获得大鼠crip2基因片段,并在大肠杆菌中表达、纯化大鼠CRIP2(cysteine-rich intestinal protein 2)蛋白。方法:从大鼠主动脉组织中提取总DNA,RT-PCR扩增出相应大小的crip2 DNA片段,与pGEM-T-easy载体连接后测序;将测序正确的crip2按照BamHⅠ和HindⅢ酶切位点克隆入原核表达载体pRSET A,将连接产物转化大肠杆菌BL21,挑出阳性克隆,IPTG诱导表达重组的6×His融合蛋白,通过镍柱进行纯化。结果:PCR获得的crip2序列与GenBank报道的一致(为707 bp);重组融合蛋白在大肠杆菌BL21中以可溶形式高效表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析,在相对分子质量为27×103处有特异的蛋白条带,经镍柱纯化后,得到了高纯度的CRIP2融合蛋白。结论:克隆了大鼠crip2基因片段,并在大肠杆菌BL21中高效表达,亲和层析纯化后获得高纯度的CRIP2融合蛋白。     

嗜麦芽寡养单胞菌D2株单加氧酶基因的克隆与表达

构建嗜麦芽寡养单胞菌D2株荧光素样单加氧酶基因表达克隆载体,并进行融合表达。PCR扩增出嗜麦芽寡养单胞菌D2菌株基因组DNA中包含单加氧酶基因约1300bp的核酸片段,将其克隆到T载体pMD-18中进行序列测定,所得序列申请并获得GenBank登记号(GQ122330)。DNA star软件分析发现该基因片段中含有一个996bp的完整开放读码框架(ORF),与GenBank中收录的S.maltophilia R551-3(CP001111/GenomeProject17107)和K279a(AM743169)的MO基因核酸序列同源性分别为90%和89%,氨基酸序列同源性分别为93%和90%。根据该ORF序列设计分别含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的表达克隆扩增引物,PCR扩增、双酶切后将产物亚克隆到pET32a载体中,经过双酶切验证,证实成功获得了表达重组载体pET32a/MO;将其转化宿主菌E.coli BL21,IPTG诱导后成功表达出54.2ku的MO融合蛋白,为该酶进一步的功能研究和开发奠定了基础。     

葡萄扇叶病毒外壳蛋白基因的克隆,序列分析及其在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR方法把葡萄扇叶病毒(GFLV)外壳蛋白基因(CP gene)分成两部分扩增,扩增产物克隆入pGEM-5Zf(+)载体,并通过BglⅢ位点连接成一完整的外壳蛋白基因,通过序列分析测得全长外壳蛋白基因为1512bp,编码504个AA＇s,与国外株系GFLV-F13相比,核苷酸同源性为88.4％,氨基酸同源性为95.8％。并且这一外壳蛋白基因在大肠杆菌E.coli DH-5α中得到了表达。     

停乳链球菌isp基因的克隆与原核表达

根据GenBank报道的停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)isp基因(GenBank:CP002215.1)序列设计引物,PCR扩增得到isp基因。片段大小为1 500 bp,与从GenBank下载的序列进行同源性比对结果为98.57%。将isp基因克隆于表达载体pET-25b,成功构建了重组质粒pET-25b-isp,将重组质粒分别转化BL21(DE3),将BL21(pET-25b-isp)阳性重组菌株经IPTG诱导后,SDS-PAGE结果显示均有蛋白表达,大小分别为53 ku与目的蛋白大小相符;Western blot检测显示,表达的蛋白为目的蛋白。对成功构建的菌株BL21(pET-25b-isp)表达条件经优化后,在温度37℃,诱导时间12 h,IPTG浓度为1 mmol/L时,蛋白有较高的表达量。     

烟草环斑病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清的制备

烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)是我国二类进境检疫危险性有害生物,对农业生产危害较大.本研究依据TRSV外壳蛋白基因cp序列设计合成了2条引物,通过RT PCR扩增得到长约1500bp的目的片段.将目的片段与质粒pET-22b(+)连接,构建了含TRSV cp基因的融合蛋白原核表达载体pETRSV-CP.序列分析表明,TRSV-SD1的cp基因全长1548bp,编码515个氨基酸与GenBank中其它TRSV分离物cp基因相比,核苷酸及推导的氨基酸序列同源性为90.7%～94.6%.将pETRSV-CP转入大肠杆菌,诱导表达.SDS-PAGE结果显示,表达的TRSV CP融合蛋白的相对分子质量约为58kDa.以此融合蛋白制备的抗血清的效价为1/1024,抗血清与TRSV具有良好的特异性反应.     

肾炎致病原重组受体相关蛋白的表达及纯化

用pGEX载体系统体外构建了Heymann肾炎致病原受体相关蛋白(RAP)重组表达质粒,经IPTG诱导,该质粒表达的融合蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达,其表达量达39．4％,经GST-Sephrose 4B亲和层析,得到了高度纯化,其诱导产生的抗体经蛋白质印迹法分析证明能识别肾皮质天然抗原44ku受体相关蛋白.RAP表达及纯化的成功为研究致病原病理性表型提供了有利条件．     

Expression and activation of an esterase from Pseudomonas aeruginosa 1001 in Escherichia coli

An expression vector was constructed to overproduce a maltose binding protein (MBP)-esterase fusion protein in Escherichia coli. Soluble fusion protein was separated by centrifugation after cell disruption. The fusion protein was partially purified with amylose resin. The higher concentration of fusion protein (above 2 mg/ml) did not show any activity but about 0.3 mg/ml of fusion protein had the highest activity (142 U/ml). It is due to the difficulty of contact between substrate and active site of enzyme in compact form at high concentration. The fusion protein over-expressed could not be separated into MBP and esterase by the action of protease ‘Factor Xa’. The esterase could be cleaved from MBP fusion protein by the treatment of SDS with the Factor Xa, and the resulting esterase activity was increased to 34% after cleavage.     

意大利蜜蜂丙糖磷酸异构酶基因的克隆及其原核表达与纯化

从意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica的肌肉组织中提取总RNA,采用RT-PCR的方法克隆蜜蜂第16号染色体上的丙糖磷酸异构酶基因的cDNA序列,将测序结果(GenBank登录号EU76098)与推导的氨基酸序列分别与GenBank中的其他物种进行同源比对分析。结果表明,该基因全长744bp,为完整的阅读框,编码247个氨基酸,成熟蛋白的理论分子量为26.89kD。比对结果显示AmTPI与家蚕、德国小镰、黄粉虫、丽蝇蛹集金小蜂、水稻等物种的基因相似性达69%以上,蛋白相似性达59%以上。将目的基因克隆到pGEX-4T-2融合表达载体上,并在大肠杆菌中得到成功表达,4h的表达量为总蛋白的42.1%。为了进一步探讨产物的酶学特性,实验还对表达产物进行纯化与浓缩。实验还构建增强型荧光真核表达质粒,为进一步研究AmTPI在真核细胞中的表达情况奠定基础。     

片球菌素pediocin PA-1基因在大肠埃希菌中的融合表达

目的构建编码细菌素pediocin PA-1基因片段的原核表达载体,诱导表达,鉴定表达产物。方法重组DNA技术构建原核表达载体pET32-papA,IPTG诱导表达,用金属亲和层析纯化,并通过SDS-PAGE与Westernblot对表达的重组蛋白进行鉴定。结果双酶切和测序鉴定显示papA片段插入正确,诱导表达后获得分子量为19 kD的融合蛋白,表达量为25%,用金属亲和层析的方法获得纯化的片球菌素pediocin PA-1。结论papA基因片段编码的蛋白质能在原核细胞中正确表达,为下一步研究该功能域的生物活性奠定了基础。     

可溶性HLA-A*0203-BSP原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的：构建HLA-A*0203重链胞外域羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的融合蛋白（HLA-A*0203-BSP）的原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR方法从HLA-A2+ 供者外周血单个核细胞(PBMC)中克隆HLA-A*0203重链基因的cDNA并测序鉴定,然后以PCR方法构建HLA-A*0203-BSP的原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达并以免疫印迹鉴定。结果：DNA测序显示,从3名HLA-A2+ 供者PBMC中克隆的cDNA中,只有从供者2获得编码HLA-A*0203重链基因的cDNA。将编码重链胞外域1-276的序列和编码BSP的序列融合,构建HLA-A*0203-BSP融合蛋白的原核表达载体并经测序验证。该融合蛋白在BL21(ED3)中获得高效表达,约占菌体总蛋白的30％;产物相对分子质量约为34 kD,与理论大小一致。Western印迹分析显示融合蛋白完全存在于包涵体中。结论：成功克隆HLA-A*0203重链基因的cDNA,构建HLA-A*0203-BSP融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达,为制备HLA-A*0203四聚体打下基础。     

一种抗菌肽和aFGF融合蛋白的构建和表达

利用PCR技术扩增出带有凝血酶Xa因子切割位点的天蚕素蜂毒素杂合肽和aFGF的融合基因,插入大肠杆菌表达载体pET-3c中,构建出表达质粒pET-aF-CM,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,氨苄青霉素抗性筛选重组转化子。IPTG诱导4h后,以包涵体形式表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的17%。将包涵体溶解后透析复性,并利用肝素亲和层析纯化,得到电泳纯的融合蛋白。Western blot分析表明,该蛋白能与aFGF抗体产生免疫反应。MTT法检测显示,融合蛋白具有促3T3Bal/b细胞分裂活性,其比活为1.471×106IU/mg。利用凝血酶Xa因子裂解融合蛋白,可以获得抗菌肽和含凝血酶Xa因子裂解序列的aFGF蛋白。分子筛回收含杂合抗菌肽,抑菌活性检测表明其对大肠杆菌K12D31具有明显抑菌活性。微量稀释法检测结果表明,回收的抗菌肽对大肠杆菌DH5α、大肠杆菌K12D31、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和绿脓杆菌的MIC分别达6.25μg/ml、10μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml和5μg/ml。     

SDH-SV2C-L4融合蛋白的表达及山梨糖脱氢酶活性检测

目的:构建SDH-SV2C-L4融合蛋白表达载体,在大肠杆菌中表达具有山梨糖脱氢酶(SDH)活性的融合蛋白。方法:将C亚型突触囊泡蛋白2大突环L4(SV2C-L4)基因与SDH基因以GGGS柔性接头连接,在大肠杆菌DH5α中表达;用NBT染色和DCIP脱色的方法检测融合蛋白的SDH活性。结果:DNA测序及SDS-PAGE结果显示构建了融合蛋白表达载体,并表达了SDH-SV2C-L4融合蛋白,相对分子质量约80×103;DCIP脱色及NBT染色均检测到融合蛋白的SDH活性。结论:与SV2C-L4融合的SDH仍具有活性,为下一步SV2C-L4活性检测方法的建立及SDH与SV2C-L4的其他相关研究奠定了基础。     

羟胺切割Neurturin融合蛋白表达载体的构建、表达产物纯化及生物活性

 Neurturin (NTN)是新近发现的一种神经营养因子 ,是 GDNF家族的成员之一 .将 5′端引入了羟胺切割位点的 h NTN基因克隆到硫氧还蛋白融合表达载体 p Thio His A,在宿主菌 BL2 1中获得了稳定、高效表达 ,表达产物以包涵体形式存在 .在变性条件下经羟胺切割、柱层析纯化后复性 ,获得纯度达 90 %以上的 rh NTN.经鸡胚背根神经节 (DRG)培养法测定具有生物学活性 .     

YFP-CD18融合蛋白在U937细胞株中的表达与鉴定

目的：构建并表达Mac-1的β链CD18与黄色荧光蛋白（YFP）的融合蛋白YFP-CD18,为进一步直视研究Mac-1在白细胞内的分布、走向及归宿提供物质条件。方法：首先将CD18的全长cDNA与pEYFP-C1进行酶切,构建YFP与CD18的N末端连接的表达载体,并将其转染至U937细胞株中进行表达。通过荧光显微镜观察转染成功后的U937细胞黄色荧光是否存在,以及流式细胞术检测确定PMA刺激后YFP-CD18活化后可否由胞浆内转位至膜上和测定PMA活化前后转染的U937细胞与其配基ICAM-1粘附活性的变化等方面进行鉴定。结果：经酶切鉴定,pYFP-CD18构建正确,转染U937细胞株后,可见YFP-CD18融合蛋白发出的黄色荧光。结论：构建完成YFP-CD18融合基因并可以在U937细胞株中进行表达。     

人R_O蛋白(60kD)编码序列的PCR产物在E.coli中的克隆与表达

通过聚合酶链反应 ( PCR)自人脾 c DNA扩增 RO 蛋白 ( 60 k D)编码 DNA片段 .将该片段定向插入麦芽糖结合蛋白 ( MBP)融合系统的 p MALTM- c载体中并转化 E.coli ( DH5α) ,通过酶联免疫印迹 ( IBT)筛选出具有 RO 抗原性的阳性克隆 .绝大部分阳性克隆表达完整的 RO 融合蛋白 ( 1 0 0k D) .但在传代过程中表达水平很快降低 ;少数阳性克隆虽然表达非完整 RO 融合蛋白 (分子量 <80k D) ,但表达水平却高而且稳定 .同时保留了很强的 RO 抗原性 .产生非完整融合蛋白的一个原因是 ,PCR碱基错配引起 RO 编码 DNA的序列缺失 ;另一原因是融合蛋白在表达过程中被降解