长穗偃麦草DREB类基因EeAP2.2 的克隆与序列分析

由于一些基因的特殊碱基序列限制,使得应用一种技术获得基因的全长cDNA序列比较困难。本研究结合RACE和Genome Walking技术从十倍体长穗偃麦草（Elytrigia elongata,2n=70）中克隆了AP2家族的一个全长cDNA序列,命名为EeAP2.2。序列分析表明,该基因具有一个837bp的开放阅读框,编码279个氨基酸残基,含有一个保守的AP2结构域,是AP2大家族的一个新成员。该基因编码的氨基酸序列与GenBank已有的普通小麦AP2家族两个同源基因编码蛋白TaDREB1和TaDREBW50（登录号分别为：AAL01124.1和AAY44605.1）具有98%的氨基酸序列一致性, 与大麦AP2蛋白HvDREB1-a（登录号AAY25517.1）,高羊茅AP2蛋白FaDREB2A （登录号CAG30547.1） 及水稻OsDREB2.2（登录号AY064403）的氨基酸序列一致性分别为 93%、86%、69%。说明该基因与小麦AP2家族基因的同源性最高。本研究除获得了长穗偃麦草一个重要抗逆转录因子基因EeAP2.2的全长cDNA序列外,也提供了一种快速、有效克隆功能基因的方法。     

苦荞谷胱甘肽转移酶(FtGST)基因的克隆与序列分析

采用RACE技术,从苦荞(Fagopyrum tatarium)中克隆得到一个谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-transferase protein,FtGST)基因。序列分析表明,FtGST基因全长DNA序列和cDNA序列编码区分别为746 bp和666 bp,DNA序列含有一个长度为80 bp(342-421 bp)的内含子;开放阅读框(ORF)长666 bp,编码221个氨基酸。生物信息学分析表明,FtGST基因推导的蛋白质含有Tau家族典型的底物结合口袋、谷胱甘肽结合位点(G-site)和疏水性底物结合位点(H-site)氨基酸残基,表明FtGST为Tau家族蛋白。     

小长蝽线粒体基因组全序列测定与长蝽总科系统发育分析

为了解小长蝽Nysius ericae（Schilling）线粒体基因组结构及长蝽总科的分子系统发育关系。本试验采用Illumina MiSeq测序平台对小长蝽线粒体基因进行测序,对基因组序列进行拼装、注释和特征分析,利用最大似然法和贝叶斯法构建基于12种长蝽总科昆虫线粒体全基因组核苷酸序列的系统发育树。小长蝽线粒体基因组全长为16 330 bp（GenBank登录号：MW465654）,基因组包括13个蛋白编码基因（PCGs）,22个tRNA基因,2个rRNA基因和1段非编码控制区。11个蛋白质编码基因的起始密码子为典型的ATN;cox1,nad4l的起始密码子为TTG。cob的终止密码子为TAG,其余蛋白编码基因的终止密码子为TAA。只有trnS1缺少DHU臂,其余tRNA基因均能形成典型的三叶草结构。12种长蝽总科昆虫线粒体全基因组序列构建的昆虫系统发育树结果显示,小长蝽与Nysius plebeius具有更近的亲缘关系,且与传统形态学分类基本一致。小长蝽线粒体基因组符合长蝽总科线粒体基因组的一般特征。结果表明小长蝽与N. plebeius的亲缘关系更近。     

巴西橡胶树HbNAC1基因的克隆和表达分析

根据EST序列信息,利用RACE技术从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)中克隆了1个NAC类转录因子基因HbNAC1,其cDNA全长为1419 bp,含有完整的开放阅读框,编码309个氨基酸。推导的氨基酸序列含有1个NAM结构域,具有典型的NAC类蛋白的结构特征,与毛果杨(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)、水稻(Oryza sativa)和拟南芥(Arabidopsisthaliana)中的相应氨基酸序列的同源性分别达79%、80%、57%和60%。聚类分析表明,HbNAC1属于NAC家族Ⅱ亚族。半定量RT-PCR分析表明,该基因在胶乳中的表达较丰富,经乙烯利刺激后其在胶乳中的表达量明显增加。     

草鱼cadm2b基因的克隆及在成体组织中的表达分析

为研究CADMs（Cell adhesion molecules）在草鱼构建抵御病害感染的第一道防线中发挥的作用,用RT-PCR和RACE方法结合测序分析,在草鱼脑组织中检测到了该基因家族成员cadm2b基因的4条不同的cDNA全长序列。序列比对结果表明这4条全长cDNA在5'端的序列完全相同,在3'端的3个局部区域有不同片段的缺失。因此,可以确定这4条不同的mRNA是cadm2b的不同剪接体。这4条不同的剪接体被分别命名为cadm2b、cadm2bX2、cadm2bX3和cadm2bX6。cadm2b的cDNA序列全长1669 bp,开放阅读框（ORF）1203 bp,编码400个氨基酸。cadm2bX2的cDNA序列全长2783 bp,开放阅读框长1323 bp,编码440个氨基酸;cadm2bX3的cDNA序列全长2755 bp,开放阅读框1296 bp,编码431个氨基酸;cadm2bX6基因的cDNA序列全长2649 bp,开放阅读框1161 bp,编码386个氨基酸。根据碱基序列所进行的氨基酸序列和蛋白结构预测显示这4个CADM2b蛋白亚型都具有CADM家族保守的4个功能区,但其C端的蛋白结合位点存在差异。CADM2b具有近膜4.1蛋白结合位点和Ⅱ型PDZ蛋白结合位点,CADM2bX2、X3缺失了PDZ蛋白结合位点,而CADM2bX6则同时缺失4.1蛋白和PDZ蛋白的结合位点。实时定量RT-PCR检测结果显示cadm2b剪接突变体是该基因mRNA的主要形式。半定量RT-PCR和套式PCR实验检测结果表明cadm2b基因在草鱼成体脑中高水平表达,在肝、肾、心脏和肌肉组织中有微量表达。这种表达模式提示草鱼中CADM2b主要是由非免疫细胞,而不是由免疫肥大细胞合成分泌的细胞黏附因子,可能通过介导免疫肥大细胞与病原靶细胞的黏附而起非特异性抵御病害感染的作用。     

中国水仙NtSOC1基因克隆及亚细胞定位

以中国水仙‘金盏银台’为实验材料,采用RACE和RT-PCR技术获得1个与开花相关的转录因子(SOC1)的同源基因NtSOC1。NtSOC1的cDNA全长1 603bp,含有1个687bp开放阅读框,编码228个氨基酸。生物信息学分析表明,NtSOC1与单子叶植物的SOC1同源基因的氨基酸序列较为相似,且在C末端同样含有一个保守性很高的SOC1motif序列,说明NtSOC1是属于SOC1/TM3亚家族基因。荧光定量PCR分析显示,NtSOC1在花芽分化阶段的表达量随着花芽的分化而升高,花芽分化结束时减少,表明NtSOC1基因可能参与中国水仙的花芽分化。成功构建了NtSOC1基因表达载体pCAMBIA1302-NtSOC1,通过农杆菌转化洋葱表皮对编码蛋白进行亚细胞定位结果显示,NtSOC1基因编码蛋白定位于细胞核,符合转录因子的亚细胞定位特征。该实验结果为进一步研究NtSOC1基因的生物学功能奠定了基础。     

绿盲蝽P450基因的克隆及增效醚对P450酶活性的抑制作用

为探讨P450介导的绿盲蝽Apolygus lucorum(Meyer-Dür)抗药性机制,合理使用杀虫药剂,本研究通过活体和离体抑制实验发现,增效醚(PBO)对绿盲蝽P450酶活性有显著的抑制作用:在处理时长为24h时,P450酶活性由未处理时的12.02pmol/min/mgPro.下降至1.63pmol/min/mgPro.,PBO对P450酶的抑制中浓度为0.256mmol/L。生物测定结果表明,PBO对三氟氯氰菊酯具有显著增效作用,增效7.2倍,而对吡虫啉、灭多威、马拉硫磷无显著增效作用。利用RT-PCR及RACE技术对绿盲蝽P450基因进行克隆,获得了2条CYP4家族基因,全长均为1631bp,含有完整的开放阅读框,编码501个氨基酸;序列比对表明这是一对等位基因,含有CYP4家族所有保守特征序列;同源性比较及系统发育分析显示这2个基因编码的氨基酸序列与褐飞虱Nilaparvata lugens CYP4CE1亲缘关系最近,同源性分别为41.5%和41.1%。     

沙田柚RING-H2 finger基因的生物信息学分析

为探讨沙田柚自交不亲和性的机理,利用高通量测序技术对沙田柚自交和异交花柱进行转录组测序,通过差异分析得到了沙田柚RING-H2 finger基因序列。采用生物信息学方法,对其编码的蛋白质从序列特征、理化性质、跨膜结构域、高级结构以及功能域等方面进行了预测和分析。结果表明:该基因全长为845 bp,开放阅读框(ORF)全长为387 bp,编码128个氨基酸,编码蛋白质的分子量为13.61 KDa,理论等电点为4.26;该蛋白质含有一个植物RING-H2 finger蛋白家族的保守结构域,为疏水性不稳定蛋白。氨基酸序列分析表明,其编码的氨基酸与甜橙(Cs4g15340.1)RING-H2 finger蛋白的相似度为98%。这些分析结果可为今后深入研究该蛋白的结构特征和功能提供参考。     

家蚕Caspase家族基因 BmCaspase-X 的克隆与功能分析

【目的】本研究旨在克隆获得家蚕 Bombyx mori Caspase家族基因,并通过RNAi技术初步分析其在家蚕细胞水平细胞凋亡中的功能。【方法】 用cDNA末端快速扩增方法（rapid amplification of cDNA ends, RACE）克隆家蚕Caspase家族一个新基因,用RNAi和流式细胞术初步分析该基因在家蚕细胞凋亡中的功能。【结果】将克隆获得的家蚕Caspase家族基因命名为 BmCaspase-X,其全长为2 105 bp,开放阅读框长为1 494 bp,编码497 aa,分子量为57.8 kDa,等电点为5.29。BmCaspase-X含有Caspase特有的结构位点。系统进化分析表明,BmCaspase-X与家蚕ICE同其他昆虫Caspase-4同源物先聚在一起,再与具有长前体结构域的昆虫其他因子聚为一类。RNAi初步结果显示该基因干扰后没有出现明显的细胞凋亡。【结论】BmCaspase-X具有典型Caspase特征,属于Caspase家族成员。目前RNAi实验结果表明 BmCaspase-X 未能引起家蚕细胞凋亡的改变。本文为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

蒙古沙冬青AmDREB2.1基因的克隆及表达分析

基于已建立的蒙古沙冬青[Ammopiptanthus mongolicus(Masxim.)Cheng f.]根的转录本数据库,分离到1个编码DREB类转录因子基因,命名为AmDREB2.1。该序列全长978 bp,包括531 bp的开放阅读框(ORF),编码176个氨基酸,具有典型的DREB转录因子保守的AP2结构域。实时荧光定量PCR分析表明,该基因能在根、叶中表达,但对干旱、低温响应不同,AmDREB2.1主要参与根的干旱胁迫应答。     

Isolation of Hox cluster genes from insects reveals an accelerated sequence evolution rate

Among gene families it is the Hox genes and among metazoan animals it is the insects (Hexapoda) that have attracted particular attention for studying the evolution of development. Surprisingly though, no Hox genes have been isolated from 26 out of 35 insect orders yet, and the existing sequences derive mainly from only two orders (61% from Hymenoptera and 22% from Diptera). We have designed insect specific primers and isolated 37 new partial homeobox sequences of Hox cluster genes (lab, pb, Hox3, ftz, Antp, Scr, abd-a, Abd-B, Dfd, and Ubx) from six insect orders, which are crucial to insect phylogenetics. These new gene sequences provide a first step towards comparative Hox gene studies in insects. Furthermore, comparative distance analyses of homeobox sequences reveal a correlation between gene divergence rate and species radiation success with insects showing the highest rate of homeobox sequence evolution.     

Hox基因与昆虫翅的特化

自从1978年E.B. Lewis描述了著名的果蝇双胸突变体（bithorax）以来,大量的比较发育遗传学研究为我们揭示了形态进化的遗传基础,从而使形态进化研究进入了一个新的时代。同时,Hox基因的研究也成为这一领域的焦点。本文综述了昆虫翅的起源及其特化类群翅的发育遗传学研究的最新进展。一般认为,原始的有翅昆虫胸腹部多附肢（包括翅）; 之后不同的体节受到了不同Hox的抑制,形成两对翅以及前后翅的分化; Ubx的不同表达导致了前后翅的分化,并且Ubx负责识别后翅。我们选择翅特化最为显著的3个类群——鞘翅目（T2鞘翅）、双翅目（T3平衡棒）和捻翅目（T2平衡棒）,结合Hox的表达情况讨论了翅的特化机理。目前已知双翅目和鞘翅目的翅的控制模式存在巨大差异,两种模式的比较研究对于理解翅的形态进化具有重要的意义。但是对捻翅目昆虫的研究则很少。     

Compartmental modulation of abdominal Hox expression by engrailed and sloppy-paired patterns the fly ectoderm

In Drosophila, segmentation genes partition the early embryo into reiterative segments along the anterior-posterior axis, while Hox genes assign segments their identities. Each segment is also subdivided into distinct anterior (A) and posterior (P) compartments based on the expression of the engrailed (en) segmentation gene. Differences in Hox expression often correlate with compartmental boundaries, but the genetic basis for these differences is not well understood. In this study, we extend previous results to describe a genetic circuit that controls the differential expression of two Hox genes, Ultrabithorax (Ubx) and abdominal-A (abd-A), within the A and P compartments of the abdominal ectoderm. Consistent with earlier findings, we show that en is essential for high Abd-A levels and low Ubx levels in the P compartment, whereas sloppy-paired (slp) is required for high Ubx levels in the A compartment. Overall, these results demonstrate that the compartmental expression of Ubx and abd-A is established through a repressive regulatory network between en, slp, Ubx and abd-A. We also show that abd-A expression in the P compartment is important for the formation of abdominal-specific cell types, suggesting that en and slp modulation of Hox expression within the A and P compartments is essential for embryonic patterning.