一种甲型肝炎灭活疫苗灭活验证试验方法的建立

目的探讨细胞培养/链特异性RT-PCR方法可否作为甲型肝炎(甲肝)灭活疫苗(L-A-1减毒株)的病毒灭活验证试验方法。方法根据甲肝病毒(HAV)L-A-1株基因组序列,设计5条基因特异性引物,提取HAV基因组RNA,应用设计的正向引物进行反转录,再进行两轮PCR扩增,通过检测HAV复制过程中的负链中间体,对甲肝灭活疫苗灭活验证试验方法进行探讨,并与《中华人民共和国药典》甲肝灭活疫苗HAV灭活验证试验方法进行比较。结果细胞培养/链特异性RT-PCR方法对HAV负链RNA特异、敏感。通过方法学验证试验表明,该方法的特异性、敏感性和重复性均良好。利用此方法对5批甲肝灭活疫苗(L-A-1减毒株)进行检测,结果全为阴性,与《中华人民共和国药典》甲肝灭活疫苗HAV灭活验证试验测定结果相同。结论细胞培养/链特异性RT-PCR方法快速、灵敏可靠,可作为检测甲肝灭活疫苗(L-A-1减毒株)HAV灭活验证试验的方法。     

TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测甲型肝炎减毒活疫苗病毒含量的研究

目的：建立一种快速定量检测甲型肝炎减毒活疫苗病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法。方法对Gen-Bank中登陆的甲型肝炎减毒活疫苗株（ L-A-1）和其他甲型肝炎病毒基因组全序列比较分析,根据其高度保守的5′端非编码区设计针对甲型肝炎减毒活疫苗株特异性引物与探针,对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化,检测该方法的特异性和灵敏性,并对甲型肝炎减毒活疫苗病毒含量进行定量检测。结果该方法对甲型肝炎减毒活疫苗株高度特异,扩增片段为207 bp,不与其他肠道病毒发生非特异性反应。在104 CCID50/管～10-1 CCID50/管之间有良好的扩增曲线,检测的灵敏度可达0．1CCID50～0．01CCID50,比普通RT-PCR高100倍。结论该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好等优点,可应用于甲型肝炎减毒活疫苗生产过程中病毒含量滴度测定及指导疫苗成品的配制。     

应用逆转录PCR检测海产贝壳类中的甲型肝炎病毒

污染水体中生长的贝壳类是传播甲型肝炎的重要媒介之一,本文介绍了用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测贝壳类中甲型肝炎病毒(HAV)的方法。贝壳类中HAV的浓集回收采用洗脱-沉淀法并加以改进,30g贝肉中的病毒浓集回收在1.5~2.0m l上清液中。RT-PCR检出限为回收样品经二次扩增后10-2稀释度。从7种39份采自大连近海海域的贝壳类样品中,用该法检测出阳性样品4种10份,阳性率为26%。说明各种贝壳类有不同程度的污染。     

甲型肝炎病毒在人胚肺二倍体细胞核酸增殖培养模型的建立

目的采用人胚肺二倍体细胞(2BS细胞)培养,结合实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测,开展甲型肝炎病毒(HAV)在2BS细胞核酸增殖培养模型的建立研究。方法将不同浓度的HAV活病毒感染2BS细胞,分别于感染后0、8、10、14、20 d收获HAV感染的细胞,应用已建立的HAV核酸检测和抗原检测方法分别检测HAV病毒核酸含量和抗原含量的动态变化。结果 HAV在2BS细胞中可有效复制和扩增,高剂量组以1×10~4 CCID_(50)/mL HAV感染0 d即可检测到HAV核酸,10～20 d病毒核酸达到峰值7.607 lg copies/μL;中剂量组以1×10~2 CCID_(50)/mL HAV感染6 d可检测到HAV核酸,6～10 d病毒增殖明显(P0.05),14～20 d病毒核酸含量达到峰值7.074 lg copies/μL并趋于稳定;而低剂量组以1 CCID_(50)/mL HAV感染后,10 d HAV开始增殖,20 d病毒核酸含量与中、高剂量组别相近且基本达到峰值;当HAV感染2BS细胞10 d时,病毒核酸检出拷贝数与感染HAV浓度呈良好的线性关系,可根据标准曲线准确反映样品中的HAV活病毒含量。细胞培养结合病毒抗原表达也可有效反映HAV的扩增情况,但较病毒核酸的出现呈明显滞后,且当样品中抗原含量低时,至少需要20 d以上才可完全检测到病毒抗原的表达。结论应用2BS细胞培养和qRT-PCR检测建立了2BS细胞HAV核酸增殖模型,可快速、准确地反映HAV活病毒在细胞中的动态感染和增殖情况,可应用于HAV活病毒的快速定量、病毒特性、药物筛选和疫苗评价等相关研究。     

细胞培养结合实时荧光RT-PCR法快速检测甲肝病毒滴度的研究

目的建立一种细胞培养与实时荧光RT-PCR相结合的快速检测甲肝病毒滴度的方法。方法根据甲肝病毒(HAV)L-A-1株5'端基因组序列,设计了2条基因特异性引物及一条探针,建立实时荧光RT-PCR法,结合细胞培养检测甲肝病毒滴度,并与ELISA检测法进行比较。结果实验中建立的方法能特异检测甲肝病毒,细胞培养8d检测病毒滴度为lg107.0CCID50/mL。同一样本重复检测3次,批内样本Ct值的变异系数最大为0.89%,批间样本Ct值变异系数最大为1.66%。建立的细胞培养结合实时荧光RT-PCR法(细胞培养8 d)与细胞培养ELISA法(细胞培养28 d)检测甲肝病毒滴度结果差异无统计学意义(P0.05)。结论该方法具有快速、灵敏、特异等优点,应用于疫苗常规检测有良好前景。     

人类甲型肝炎动物模型（狨猴）的研究

本文报道以不同剂量的不同HAV毒株,经静脉和胃肠道分别接种普通狨猴和白须狨猴后,其血清ALT、AsT和LDH活性均见升高。对酶活性比接种前增加,大于十3SD值的6只狨猴作肝活组织检查,见有与急性病毒肝炎相一致的组织病理变化。此外,用免疫电镜法检出狨猴粪便中HAV颗粒,狨猴接种HAV后36天,血清IgM类和总抗HAV抗体均阳转。上述结果提示,普通狨猴有可能作为研究甲型肝炎的理想动物模型。     

马铃薯病毒一步法多重RT-PCR检测技术的构建

根据马铃薯病毒PVX、PVY、PVA、PLRV的CP基因序列设计4对特异性引物,通过对试剂浓度和反应条件进行优化,建立了能够同步检测PVX、PVY、PVA、PLRV的一步法多重RT-PCR检测方法。该方法对PVX、PVY、PVA、PLRV扩增出的靶带大小分别为732、422、132和336 bp,凝胶电泳易辨别区分。病毒RNA最低检测限度为7.8 pg/μL,对PVM、PVS、AMV、TMV及PSTVd的扩增为阴性。研究结果表明,该方法特异、灵敏,比两步法多重RT-PCR检测更加快速、简便,提高了检测效率,降低检测成本,为马铃薯病毒的高效检测提供了有效手段。     

李痘病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的:建立李痘病毒(PPV)特异、灵敏、快速的实时荧光定量RT-PCR检测方法,用于核果类种苗的健康评测及李痘病毒疫情监测。方法:根据PPV-D株系和PPV-M株系的外被蛋白(CP)基因保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,扩增全长CP基因片段,并将其克隆到pMD18-T载体上,构建质粒标准品,建立PPV的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估。结果:此荧光定量RT-PCR方法对PPV检测呈现高灵敏度和高特异性,与马铃薯Y病毒和马铃薯X病毒无交叉反应,最低检出限可达1.6×102拷贝/μL,标准曲线的相关系数为0.999 18。结论:建立了李痘病毒的荧光定量RT-PCR检测方法,可望应用于检验检疫部门对李痘病毒的快速检测。     

仙台病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

目的建立一种快捷、灵敏的检测方法,即反转录-环介导等温扩增方(RT-LAMP)用于仙台病毒(SeV)的检测。方法根据Gen Bank公布的SeV序列(DQ219803.1),在其保守区域设计了六套LAMP引物,利用LAMP Real-Time Turbidimeter LA-320C仪监测反应进程并筛选最佳引物、反应条件,建立对SeV核酸进行特异性扩增的RT-LAMP检测方法,并可通过加入目测荧光检测试剂肉眼判断结果。对所建立的方法进行了敏感性、特异性评估并对92份样品进行了检测。结果该方法在63℃恒温下作用60 min,SeV RNA获得了高效率的特异性扩增,与其余常见小鼠病毒无交叉反应;最低检出量为2.1TCID_(50) SeV,比RT-PCR方法高102倍;肉眼判断结果与RealTime Turbidimeter LA-320仪监测结果一致;通过对92份样品的RT-LAMP,RT-PCR和间接ELISA方法的检测比对,三者符合率为100%。结论建立的SV RT-LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏,操作简单的特点,具有良好的应用前景。     

戊型肝炎病毒荧光定量RT-PCR快速检测技术的建立和初步应用

利用DNAMAN软件对GenBank登录的戊型肝炎病毒四个主要基因型代表株的序列进行分析, 选择其高度保守的ORF2区域设计合成引物和探针, 并用包含有扩增区域的核苷酸片段进行体外转录制备标准品cRNA。在对荧光定量RT-PCR的反应条件优化的基础上, 建立了适用于戊型肝炎病毒主要基因型检测的荧光定量RT-PCR检测技术。该检测技术可以有效检测I型和IV型戊型肝炎阳性病料, 而对猪的其它几种疫病阳性病料则为阴性结果, 证实本技术的特异性强、可靠性好。对阳性标准品的检测结果表明, 所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR灵敏度可达2.0×101拷贝/反应, 相比于巢式RT-PCR方法, 其灵敏度高10~100倍以上。在对54份临床样品的检测中, 进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好, 可满足戊型肝炎病毒早期快速诊断的需要。     

Real-time nucleic acid sequence-based amplification assay for detection of hepatitis A virus

A nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) assay in combination with a molecular beacon was developed for the real-time detection and quantification of hepatitis A virus (HAV). A 202-bp, highly conserved 5' noncoding region of HAV was targeted. The sensitivity of the real-time NASBA assay was tested with 10-fold dilutions of viral RNA, and a detection limit of 1 PFU was obtained. The specificity of the assay was demonstrated by testing with other environmental pathogens and indicator microorganisms, with only HAV positively identified. When combined with immunomagnetic separation, the NASBA assay successfully detected as few as 10 PFU from seeded lake water samples. Due to its isothermal nature, its speed, and its similar sensitivity compared to the real-time RT-PCR assay, this newly reported real-time NASBA method will have broad applications for the rapid detection of HAV in contaminated food or water.     

Real-Time Nucleic Acid Sequence-Based Amplification Assay for Detection of Hepatitis A Virus

A nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) assay in combination with a molecular beacon was developed for the real-time detection and quantification of hepatitis A virus (HAV). A 202-bp, highly conserved 5′ noncoding region of HAV was targeted. The sensitivity of the real-time NASBA assay was tested with 10-fold dilutions of viral RNA, and a detection limit of 1 PFU was obtained. The specificity of the assay was demonstrated by testing with other environmental pathogens and indicator microorganisms, with only HAV positively identified. When combined with immunomagnetic separation, the NASBA assay successfully detected as few as 10 PFU from seeded lake water samples. Due to its isothermal nature, its speed, and its similar sensitivity compared to the real-time RT-PCR assay, this newly reported real-time NASBA method will have broad applications for the rapid detection of HAV in contaminated food or water.     

甲肝病毒减毒株(H2)RNA的全长RT-PCR扩增

通过RT-PCR技术扩增了甲肝病毒减毒株(H₂)全长RNA,并对长片段RT-PCR扩增进行了方法学上的探讨.采用抗血清特异沉淀病毒;盐酸胍-酸性酚、氯仿一步法分离纯化病毒RNA,可得到高质量的RNA样品;以此RNA为模板,在无RNA酶的逆转录酶作用下,合成单链cDNA;继续以此cDNA为模板,利用32 mer寡核苷酸引物, 在Taq和Deep Vent DNA多聚酶的作用下进行PCR扩增,得到7.4 kb的扩增产物.     

Duration of viral RNA circulation in blood of patients with hepatitis A

Duration of hepatitis A virus (HAV) RNA circulation in blood of patients with HA was assessed and compared with intensity of cytolytic syndrome. Detection of viral RNA was performed by RT-PCR method with specific primers to VP1/P2A region of HAV genome. 54 blood serum samples from 40 patients were prospectively studied on the presence of HAV RNA. The latterwas detected in 53.7% of serum samples. The greatest number of positive results of HAV RNA detection in blood of the patients with HA was obtained from 8th to 21st day of illness (77.4%). Prolonged viremia (42+/-9 days) was observed in more than 20% of the patients. The maximal time of HAV RNA daetection in blood serum amounted 74 days (period of follow-up). HAV RNA was present in almost all patients with AIAT activity higher than 500 U/l regardless of duration of illness.