水飞蓟宾诱导肺腺癌Anip973 细胞凋亡的分子机制研究

目的:探讨水飞蓟宾诱导肺腺癌Anip973细胞系细胞凋亡的分子机制。方法:采用MTT法、倒置显微镜和电子显微镜等形态学检测以及流式细胞仪(FCM)技术检测、DNALadder分析、凋亡分子PARP的表达检测细胞凋亡,同时进行凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9表达活性分析。结果:(1)水飞蓟宾对人肺腺癌Anip973细胞系细胞的增殖有显著抑制作用;(2)水飞蓟宾作用Anip973细胞48h后,随着浓度的增加,倒置显微镜下可见细胞数目减少,胞体变小、变圆,到高浓度时出现较多的死亡细胞;(3)扫描电镜观察发现,随着水飞蓟宾作用浓度的增加,Anip973细胞中出现增多的凋亡细胞,凋亡细胞表现出典型的超微结构特征;(4)流式细胞仪检测的结果发现,随着药物作用时间的延长,Anip973细胞的G1期细胞比例增多,S期细胞明显减少,G2期细胞略有减少,并出现明显的凋亡峰。(5)水飞蓟宾作用后的Anip973细胞出现明显的DNALadder和PARP降解增加等凋亡特征;(6)水飞蓟宾作用后,Anip973细胞中的凋亡相关蛋白Bax表达增加、caspase-3和caspase-9酶活性增加,而Bcl-2表达降低。结论:水飞蓟宾在体外有抑制人肺腺癌细胞Anip973的增殖作用,并通过激活线粒体依赖的caspase凋亡通路,诱导其凋亡。     

水飞蓟宾诱导肺腺癌Anip973细胞凋亡的分子机制研究

目的：探讨水飞蓟宾诱导肺腺癌Anip973细胞系细胞凋亡的分子机制。方法：采用MTT法、倒置显微镜和电子显微镜等形态学检测以及流式细胞仪（FCM）技术检测、DNALadder分析、凋亡分子PARP的表达检测细胞凋亡,同时进行凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9表达活性分析。结果：（1）水飞蓟宾对人肺腺癌Anip973细胞系细胞的增殖有显著抑制作用;（2）水飞蓟宾作用Anip973细胞48h后,随着浓度的增加,倒置显微镜下可见细胞数目减少,胞体变小、变圆,到高浓度时出现较多的死亡细胞;（3）扫描电镜观察发现,随着水飞蓟宾作用浓度的增加,Anip973细胞中出现增多的凋亡细胞,凋亡细胞表现出典型的超微结构特征;（4）流式细胞仪检测的结果发现,随着药物作用时间的延长,Anip973细胞的G1期细胞比例增多,S期细胞明显减少,G2期细胞略有减少,并出现明显的凋亡峰。（5）水飞蓟宾作用后的Anip973细胞出现明显的DNALadder和PARP降解增加等凋亡特征;（6）水飞蓟宾作用后,Anip973细胞中的凋亡相关蛋白Bax表达增加、caspase-3和caspase-9酶活性增加,而Bcl-2表达降低。结论：水飞蓟宾在体外有抑制人肺腺癌细胞Anip973的增殖作用,并通过激活线粒体依赖的caspase凋亡通路,诱导其凋亡。     

PTD融和蛋白的原核表达及其抗体制备

目的:为制备凋亡素重组蛋白抗体,首先获得凋亡素重组蛋白融合基因LTA,而且通过原核表达系统表达重组蛋白并制备其抗体,为进一步利用凋亡素重组蛋白导向治疗肿瘤的检测奠定基础.方法:应用重叠延伸的基因融合技术将LHRH(黄体生成激素释放激素)基因、TAT(HIV-1反式转录激活因子)基因和凋亡素基因重组,构建成凋亡素重组蛋白原核表达载体pET-28a-LTA,随后将表达质粒转入BL21菌株,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,将已表达的重组蛋白通过Ni-NTA亲和色谱柱进行纯化,并制备LTA凋亡素重组蛋白抗体.结果:表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,LTA蛋白融合基因获得高效表达,凝胶薄层扫描分析表明表达蛋白占菌体蛋白12.6%.LTA蛋白经Ni-NTA亲和色谱柱柱纯化,以纯化蛋白为抗原免疫獭兔制备凋亡素重组蛋白抗血清.结果表明抗体的效价为1: 12800.结论:应用重叠延伸的基因融合技术获得凋亡素重组蛋白融合基因LTA,通过原核表达系统表达重组蛋白并制备其抗体.     

TAT-MafA融合蛋白诱导小肠细胞系IEC-6表达胰岛素

借助蛋白质转导技术,利用胰岛β细胞转录因子MafA诱导小肠细胞系IEC-6表达胰岛素,为糖尿病的治疗提供新的方法。将TAT基因与MafA基因一起插入p32a（＋）载体中,构建TAT—MafA融合蛋白原核表达载体,转化BL21获得表达菌株,经IPTG诱导和Ni柱亲和层析纯化TAT-MafA融合蛋白,用1μM浓度的该融合蛋白孵育IEC-6细胞12h和24h后,分别进行进胞检测和胰岛素表迭检测。实验结果表明,细胞免疫荧光和Western-blot方法检测到经TAT—MafA融合蛋白作用12h后的IEC-6细胞中有该蛋白,并经细胞免疫荧光和RT—PCR的方法检测出TAT—MafA作用24h后的IEC-6细胞中有胰岛素的表达。因此,TAT—MafA融合蛋白可以高效进入小肠细胞系IEC-6细胞,并且进胞后仍保持MafA原有的生物学活性,能启动胰岛素基因的表达,诱导IEC-6成为胰岛素表达细胞。     

带有蛋白转导结构域的Bcr/Abl癌蛋白片段的表达及其跨膜转运

HIV 1编码的反式激活蛋白TAT具有将细胞外蛋白转导进入细胞的基序 ,称为蛋白转导结构域 (PTD) .为研究PTD介导的PTD Bcr Abl融合蛋白的跨膜转运 ,合成了编码PTD的基因片段 ,并与PCR扩增的慢性粒细胞白血病癌蛋白bcr abl基因片段融合 .在大肠杆菌中表达纯化了融合蛋白 ,将纯化的融合蛋白加入培养的HL60细胞和C2C12细胞后 ,发现PTD基序可以介导Bcr Abl蛋白自由从细胞外跨膜转导进入细胞内 .研究结果可能为用外源蛋白负载 (loading)免疫活性细胞如抗原提呈细胞提供新的途径 .     

PTD融合蛋白的原核表达及其抗体制备

目的：为制备凋亡素重组蛋白抗体,首先获得凋亡素重组蛋白融合基因LTA,而且通过原恢表达系统表达重组蛋白并制备其抗体,为进一步利用凋亡素重组蛋白导向治疗肿瘤的检测奠定基础。方法：应用重叠延伸的基因融合技术将LHRH（黄体生成激素释放激素）基因、TAT（HW—1反式转录激活因子）基因和凋亡素基因重组,构建成凋亡素重组蛋白原核表达载体pET-28α～LTA,随后将表达质粒转入BL21菌株,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,将已表达的重组蛋白通过Ni—NTA亲和色谱柱进行纯化,并制备LTA凋亡素重组蛋白抗体。结果：表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测．LTA蛋白融合基因获得高效表达,凝胶薄层扫描分析表明表达蛋白占菌体蛋白12．6％。LTA蛋白经Ni—NTA亲和色谱柱柱纯化,以纯化蛋白为抗原免疫獭兔制备凋亡素重组蛋白抗血清。结果表明抗体的效价为1：12800。结论：应用重叠延伸的基因融合技术获得凋亡素重组蛋白融合基因LTA,通过原核表达系统表达重组蛋白并制备其抗体。     

凋亡蛋白的基因表达、纯化和体外活性

来源于鸡贫血病毒的小分子蛋白质凋亡蛋白（apoptin）能够选择性诱导肿瘤细胞凋亡,原核表达的凋亡蛋白是否具有体内的凋亡活性,对于用无细胞体系研究凋亡蛋白诱导肿瘤细胞凋亡机制和今后更好地开发凋亡素的临床应用具有重要意义。据此,采用原核表达载体pBV220和 pPROEXHT进行了凋亡蛋白的原核表达和纯化复性研究,体外证明了凋亡蛋白的凋亡诱导活性,并揭示原核表达的凋亡蛋白即使没有细胞质的参与,仍具有诱导细胞核凋亡的活性。     

含蛋白转导域的SARA/SBD融合蛋白的原核表达、纯化及生物学活性鉴定

目的:SARA/SBD是纤维化形成过程中的负性调节因子。原核表达、纯化含反式激活蛋白(TAT)蛋白转导域(PTD)的TAT PTD-SARA/SBD融合蛋白,并鉴定其生物学活性。方法:将TAT PTD-SARA/SBD基因克隆入带His标签的原核表达载体pET-44a(+)中,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,表达产物经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化后,SDS-PAGE和Western印迹鉴定目的蛋白;用人腹膜间皮细胞系(HPMC),通过免疫细胞化学方法检测其穿膜能力,及与TGF-β1信号通路中Smad2因子的共定位情况。结果:用基因工程方法表达和纯化了TAT PTD-SARA/SBD融合蛋白,目的蛋白约占菌体总蛋白的20%左右,且以可溶形式表达,经Ni2+-NTA纯化后,所获蛋白纯度高于95%(HPLC归一法);功能学实验结果显示该蛋白能穿过胞膜,主要定位于胞核,且与Smad2因子具有核内共定位。结论:表达了TAT PTD-SARA/SBD融合蛋白,该蛋白具有生物学活性。     

TAT-EDAG融合蛋白的原核表达及其转导活性的研究

HIV-TAT蛋白转导域（PTD）是新近发现的一种在蛋白转导过程中能高效穿过生物膜的结构域,它能将与之连接的多肽、蛋白质及DNA等分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞,转导效率高而对细胞没有损伤.构建了TAT-EDAG、TAT-GFP融合蛋白原核表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）细胞中实现了两种融合蛋白的可溶性原核表达,在非变性条件下进行蛋白纯化,获得了纯度在90%以上的融合蛋白.脱盐处理后,利用TAT-GFP转染体外培养的鼠成纤维细胞证实了TAT转导肽的生物活性;利用TAT-EDAG转染体外培养的HL-60细胞,Western blotting分析表明：TAT-EDAG可以导入HL-60细胞中.这为下一步应用于体外造血干细胞扩增研究奠定了基础.     

过表达CREG抑制高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡

目的：探讨E1A激活基因阻遏子（Cellular repressor of ElA-stimulated genes,CREG）在高糖引起的人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs）损伤中的作用,为寻找糖尿病血管病变新的治疗靶点提供实验依据。方法：采用胶原酶消化法分离原代HUVECs,并用内皮细胞标志物CD31免疫荧光染色进行鉴定。分别用含有5．5mmol／1葡萄糖（正常糖对照组）、5．5mmol／1葡萄糖＋27．5mmol／1甘露醇（渗透压对照组）或33mmol／l葡萄糖（高糖组）的培养液培养HUVECs48h。WesternBlot检测剪切体caspase-3表达;AnnexinV／PI双染后流式细胞术检测细胞凋亡。通过感染表达CREG基因的腺病毒获得CREG过表达的HUvECs,WesternBlot及流式细胞术评价CREG过表达对HUVECs凋亡的影响。结果：高糖处理48h后,HUVECs内剪切体caspase-3的蛋白表达增加,细胞凋亡率增加;过表达CREG后,高糖处理的HUVECs内剪切体Caspase-3表达和凋亡细胞比例均明显降低,但仍高于正常糖对照组。结论：CREG过表达可抑制高糖引起的HUVECs凋亡。     

野生型P53、P16基因协同对肺腺癌细胞系生长抑制作用的研究

为了探讨野生型P53基因及P16基因在恶性肿瘤基因治疗中的作用,用腺病毒为载体将野生型P53基因转入高、低转移的肺腺癌细胞系Anip973、AGZY83-a和经野生型P16基因质粒转染的高、低转移肺腺癌细胞系Anip973（Anip973P16）、AGZY83-a（AGZY83-aP16）。对各组转染细胞进行生长曲线、MTT生长抑制率、原位末端标记、Western-blotting等技术检测分析。结果发现（1）野生型P53蛋白的过表达对上述肺腺癌细胞系均呈现出较强的生长抑制作用。（2）野生型P53蛋白的过表达对高转移肺癌细胞系Anip973的抑制作用明显高于低转移细胞系AGZY83-a。（3）野生型p53蛋白的过表达对经野生型P16基因转染的高、低转移的肺癌细胞Anip973、AGZY83-a抑制作用明显高于未经P16基因转染的细胞。野生型P53基因可以作为肺腺癌基因治疗的候选基因。肿瘤抑制基因P53、P16的联合转染可能是对肺腺癌进行基因治疗的有效手段。 Abstract：To investigate the suppression effect of tumor suppressor genes in lung adenocarcinoma cell lines,we transferred a pair of lung adenocarcinoma cell lines with different metastasis potential,Anip973(High-metastasis potential cell line) and AGZY83-a (Low-metastasis potential cell line)and this pair of cell lines transfected with P16 gene:AGZY83-a P16 and Anip973 P16 with wild type P53 gene with adenovirus vector.The suppression effects of P53 gene were evaluated by cell growth curve,MTT,western-blotting analysis and TUNEL technique.Overexpression of wild-type P53 gene in AGZY83-a,Anip973,Anip973 P16 and AGZY83-a P16 inhibited the growth of these four kinds of lung cancer cells and induced apoptosis of the cells.The suppression effect of P53 gene in Anip973 and Anip973 P16 was higher than AGZY83-a and AGZY83-a P16 while co-expression of P53 and　P16 in this pair of cell lines inhibited the cells more efficiently comparing with the expression of P53 alone.Wild-type P53 gene might act as a candidate gene in lung adenocarcinoma gene therapy while co-transfection of P53 and P16 genes was a more effective method.     

δ-睡眠肽与GFP融合蛋白的表达和纯化

构建δ-睡眠肽(DSIP)蛋白与GFP的融合基因表达载体,高效表达和纯化GFP-DSIP融合蛋白。通过SOE-PCR拼接DSIP全长编码基因,并使得DSIP上游具有肠激酶识别位点,经双酶切定向克隆至表达载体pET-28a,构建重组载体pET-28a-DSIP,通过PCR扩增GFP全长编码基因,经双酶切定向克隆至pET-28a-DSIP,构建原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,通过双酶切和测序鉴定后,导入E.coli BL21宿主菌中,IPTG诱导表达融合蛋白,采用镍亲和层析和分子筛凝胶层析获得高纯度蛋白,SDS-PAGE分析鉴定。经测序鉴定成功构建了原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,在IPTG诱导下获得可溶性的绿色荧光蛋白与睡眠肽的融合蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化成功获得高纯度的融合蛋白。成功构建了DSIP与GFP融合基因的重组表达载体,确定了GFP-DSIP融合蛋白诱导表达的最佳条件,获得了较高纯度的融合蛋白,为进一步研究DSIP蛋白的生物学功能奠定了基础。     

RF克隆结合巢式PCR构建金黄色葡萄球菌组氨酸蛋白激酶AgrC表达载体

AgrC蛋白是位于金黄色葡萄球菌细胞膜上的组氨酸激酶,能够感受细胞外的化学信号并将信号传递到细胞内,进而调控细胞内与致病性相关的一系列基因的表达.利用无限制克隆法(RF克隆),并结合巢式PCR成功构建了AgrC表达载体pET-28a-AgrC.将表达载体电转入大肠杆菌中,并利用IPTG进行诱导表达AgrC蛋白.再经过低温超高压破碎、超高速离心、金属螯合层析与尺寸排阻层析等过程,分离纯化得到AgrC蛋白.     

Comparison of Enterococcus quantitative polymerase chain reaction analysis results from fresh and marine waters on two real-time instruments

Apoptin, a protein derived from chicken anemia virus (CAV), induces apoptosis selectively in human tumor cells as compared with normal cells. This activity depends on phosphorylation and relocation of apoptin to the nucleus of cancer cells. Here, we describe an in vitro kinase assay that allows the biochemical characterization of apoptin kinase activity in tumor cells. The kinase phosphorylates apoptin in a strictly ATP-dependent fashion and in a broad salt range. The kinase activity is present constitutively in both cytoplasm and nucleus of various human tumor cells. Q-column chromatography showed that both cytoplasmic and nuclear fractions have identical fractionation characteristics, suggesting that the same kinase is present in both cellular compartments. Kinase activity derived from positive Q-column fractions bound to amylose-maltose-binding protein (MBP)-apoptin and could be eluted with ATP only in the presence of the cofactor Mg(2+). Apparently, unphosphorylated apoptin interacts with the kinase and is released only after phosphorylation has occurred, proving that our assay recognizes the genuine apoptin kinase. This is further corroborated by the finding that apoptin is phosphorylated in vitro at positions Thr108 and Thr107, in concert with earlier in vivo observations. Our assay excludes cyclin-dependent kinase 2 (CDK2) and protein kinase C beta (PKC-β), previously nominated by two separate studies as being the genuine apoptin kinase.     

Id 基因在多种肺癌细胞中的表达及意义

目的：研究Id基因在肺癌和永生化支气管上皮细胞中的表达,探讨其在肺癌细胞中表达的意义。方法：利用半定量RT—PCR和Western blot方法检测多种肺癌和永生化支气管上皮细胞中Id1—Id4 mRNA和Id1—Id4蛋白的表达。结果：A549、NCI—H460、NCI—H446、SK—MES—1、Anip973中Id1-Id3 mRNA均高表达,Id1相对表达较强;而AGZY和MP-184中未表达Id1-Id3 mRNA;腺癌细胞均表达了Id4 mRNA,而NCI-H446、SK—MES—1未表达Id4mRNA。A549,NCA—H460,NCA—H446,SK—MES—1,Anip973中Id1,Id2,Id3蛋白均高表达,A549,NCA—H446,Anip973中Id2的表达高于NCA—H460,SK—MES—1;A549,NCA—H460,Anip973有出的高表达,NCI—H446,SK—MES—1无Id4的表达,Id1-Id4在AGZY和MP-184中均耒表达。结论：4种Id基因均作为癌基因在肺癌的发生发展中发挥作用,Id1,Id2,Id3与肺癌细胞的恶性程度以及增殖和转移密切相关,Id4可做为肺腺癌的检测标志物。     

Expression and refolding of recombinant human alpha-tocopherol transfer protein capable of specific alpha-tocopherol binding

alpha-Tocopherol transfer protein (alpha-TTP) is a cytosolic protein found predominantly in mammalian liver that is proposed to be responsible for the stereoselective uptake of alpha-tocopherol from the diet. Although recombinant alpha-TTP has been reported previously, little detail has been provided about the yields and competency of the recovered protein at binding tocopherols and other ligands. In this work, we report the successful expression and refolding of a recombinant human alpha-TTP. Ligation-independent cloning generated a construct in pET-30 encoding an alpha-TTP fusion protein (pET-30/ttp) containing a six-histidine tag and an S-tag, each cleavable by a separate protease upon expression in Escherichia coli. Overexpression of the protein led to the formation of inclusion bodies that were solubilized in 8 M urea and purified by metal chelate affinity chromatography. Another construct in pET-28b (pET-28b/ttp) provided a soluble protein product after expression that contained a 40-amino-acid N-terminal extension, which can be reduced to 21 amino acids by cleavage with thrombin. The success of different refolding experiments was assessed using a Lipidex gel-based tocopherol binding assay. The best recovery of refolded recombinant alpha-TTP fusion capable of binding alpha-tocopherol was provided by matrix-assisted refolding in the presence of 0.5 M arginine. Cleavage of the fusion protein with Factor Xa successfully generated the full-length wild-type protein with no additional N-terminal amino acids. The resulting purification scheme provides recombinant alpha-TTP in good yield and purity for investigation of both its structure and its binding affinities for different ligands including natural and synthetic tocols.     

Proteasomal insensitivity of apoptin in tumor cells

The small viral protein apoptin is capable of inducing apoptosis selectively in human tumor cells. In normal cells apoptin localizes in the cytoplasm where it forms aggregates, becomes epitope-shielded and eventually degraded. By inhibiting the proteasome activity with the chemical inhibitors bortezomib and Ada-Ahx(3)L(3)VS apoptin levels can be stabilized in normal cells similar to the tumor suppressor p53 protein. In contrast, proteasome inhibition in tumor cells did not affect the apoptin stability while it still stabilized p53 levels. Apparently, apoptin is degraded by proteasomal activity in normal human cells, a process that no longer takes place in tumor cells. This loss of proteasomal susceptibility appears to be specific for apoptin.     

pET28a-TAT-LacZ重组子的构建

为了构建高表达pET28a-TAT-LacZ重组子,观察表达的融合蛋白TAT-β-Gal能否穿过生物膜,使用人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a组氨酸编码区后再连接lacZ基因,组成pET28a-TAT-LacZ重组表达子,转化大肠杆菌,利用组氨酸亲和层析柱纯化TAT-β-Gal融合蛋白,将融合蛋白加入培养的平滑肌细胞。得到高度纯化的、有活性的TAT-β-Gal融合蛋白, TAT-β-Gal在短时间内进入体外培养平滑肌细胞,成功地构建了高表达pET28a-TAT-LacZ重组子,并在体外培养的细胞中证实TAT-β-Gal融合蛋白穿透生物膜的能力,为肽类、生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础。