人细小病毒B19病毒样颗粒的制备

采用昆虫杆状病毒表达系统,制备人细小病毒B19病毒样颗粒(VLPs)。先通过PCR方法合成细小病毒B19衣壳蛋白基因VP2,将其克隆到pFastBac1质粒,然后转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的E.coliDH10Bac感受态细胞,获得重组杆状病毒表达质粒Bacmid-VP2。在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,包装重组杆状病毒rBac-VP2。利用rBac-VP2感染Sf9细胞表达B19VP2蛋白,通过间接免疫荧光、Western blotting等方法鉴定目的蛋白表达。采用两次超速离心的方法对表达产物进行纯化,纯化产物在透射电镜下可见直径约22nm的VLPs。本研究成功制备了人细小病毒B19的VLPs,为B19感染血清学检测方法的建立提供了参考。     

重组人PLCζ蛋白在昆虫细胞/杆状病毒表达系统内的表达、纯化及活性测定

PLCζ是PLC家族的一种新型同工酶,在哺乳动物卵母细胞激活中起着极其重要的作用。近年来,体外大量表达和纯化有活性的PLCζ蛋白用于结构生物学研究一直未能获得成功。本研究首次在杆状病毒表达系统中表达和纯化重组人PLCζ蛋白,首先将人PLCζ基因克隆至pFastBac-HTA质粒构建重组载体,转化DH10Bac发生位点特异性转座,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid-PLCζ;在脂质体介导下将穿梭质粒转染Sf9昆虫细胞产生重组病毒,扩增病毒感染Sf9昆虫细胞进行蛋白表达;利用Ni~(2+)亲和柱及分子筛来纯化蛋白,并通过考马斯亮蓝染色、Western blotting及飞行时间质谱对蛋白进行鉴定,并进行酶活性测定。结果显示重组蛋白在Sf9昆虫细胞感染杆状病毒后72 h达到峰值并以分泌形式表达在细胞培养基中,Ni~(2+)亲和柱及分子筛纯化后的重组蛋白经Western blotting及电离飞行时间质谱鉴定为PLCζ蛋白,酶活性可达326.8 U/mL。该实验结果为重组人PLCζ蛋白大规模生产和生物医学应用研究提供了可参考利用的技术。     

重组人可溶性PDGFRβ/Fc在昆虫细胞Sf9中的表达

【目的】利用昆虫细胞Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达血小板源性生长因子受体β (PDGFRβ)链膜外区与人IgG Fc片段的可溶性受体融合蛋白sPDGFRβ/Fc,并检测重组蛋白的特异性和生物活性。【方法】采用Bac-to-Bac系统,构建重组转移质粒pFastbac-sPDGFRβ/Fc,转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,使目的基因与杆状病毒基因组DNA发生位点特异性重组,获得重组病毒DNA,将其通过脂质体转染昆虫细胞Sf9获得重组病毒。将该重组病毒感染Sf9无血清细胞系,在Sf9细胞中表达sPDGFRβ/Fc,对表达产物进行Western blotting检测和Protein A亲合层析纯化,并进一步通过MTT法检测获得的重组蛋白生物学活性。【结果】重组病毒感染Sf9细胞后,经Western blotting分析,能检测到一条分子量约为97 kDa的特异性条带,与目的蛋白大小相符。通过Protein A亲和层析,获得了纯度达75％以上,表达量为1 μg/mL细胞培养上清的重组融合蛋白,MTT结果显示该重组融合蛋白sPDGFRβ/Fc具有抑制PDGF刺激的Balb/c 3T3细胞增殖的能力。【结论】具有生物活性的重组可溶性受体融合蛋白sPDGFRβ/Fc可在昆虫细胞中成功地得到表达。     

DEK蛋白的真核表达纯化及其活性检测

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达DEK蛋白并进行纯化。首先以pFastBacI质粒构建重组质粒pFastBacI-DEK,转化DH10Bac大肠杆菌后获得重组穿梭载体Bacmid-DEK,通过脂质体介导转染Sf9细胞产生具有强感染力的重组杆状病毒AcNPV-DEK。用此重组杆状病毒AcNPV-DEK感染Sf9细胞表达His-DEK融合蛋白。在非变性条件下,利用Ni-NTA agarose对表达的His-DEK融合蛋白进行纯化,经SDS-PAGE和Western blotting分析,在50 kDa处出现特异性蛋白条带并证实其为His-DEK融合蛋白。凝胶迁移阻滞实验表明,融合蛋白His-DEK与DNA 的结合具有结构特异性,其与超螺旋型DNA结合活性强于与线性化DNA的结合活性。真核表达并纯化的融合蛋白His-DEK与DNA的结合活性要明显强于原核表达的融合蛋白His-CDB。DEK 蛋白的磷酸化修饰会阻碍其与DNA的结合,而Sf9细胞中表达的融合蛋白His-DEK存在磷酸化修饰,将His-DEK去磷酸化后,其与DNA的结合活性有所提高。     

人乳头瘤病毒18型L1蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达

目的:利用昆虫杆状病毒系统表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白。方法:将L1基因与p Fast Bac1(p FB1)载体连接,构建转移载体p FB1-L1,转化含Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,获得穿梭质粒r Bacmid-L1;r Bacmid-L1转染Sf9细胞,获得重组病毒r Bac-L1;PCR法检测重组杆状病毒基因组L1基因,间接免疫荧光法和Western印迹检测L1蛋白的表达。结果:穿梭质粒r Bacmid-L1经PCR鉴定构建正确;感染r Bac-L1的Sf9细胞经PCR扩增可见1629 bp的特异性条带,间接免疫荧光检测可见绿色荧光,Western印迹鉴定与小鼠抗L1单克隆抗体发生特异性反应,在相对分子质量约60 000处可见特异性条带。结论:利用昆虫杆状病毒表达系统表达了HPV18 L1蛋白。     

水稻条纹病毒RNA聚合酶在昆虫细胞中的表达

[目的]利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)RNA聚合酶(RdRp)基因。[方法]RT-PCR扩增RdRp基因功能区片段,克隆于转移载体p Fast Bac HTb上,转化到大肠杆菌DH10Bac中,得到重组杆状病毒表达载体Bacmid-rp。提取Bacmid-rp DNA,转染Sf9细胞获得重组病毒v Ac-rp。将重组病毒v Ac-rp感染Sf9细胞使目的蛋白在细胞内表达,并利用亲和层析纯化,SDS-PAGE检测RdRp的表达情况。将纯化的RdRp蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western blot分析RdRp的免疫原性。[结果]RSV RdRp基因功能区能够在Sf9细胞中表达,蛋白分子量约为45k Da,与预测大小一致,且可与RdRp抗血清发生特异性反应。[结论]在真核细胞中成功表达了RSV RdRp,并得到了纯化的RdRp和其多克隆抗体。     

膜蛋白KCNN1在昆虫细胞Sf9中的表达与纯化

目的:利用昆虫细胞表达系统真核表达并纯化小电导钙激活钾离子通道蛋白1(KCNN1)。方法:以基因重组方法构建杆状病毒穿梭质粒reBacmid-KCNN1,将其转染至杆状病毒/Sf9细胞表达系统表达目的蛋白,并用Western印迹鉴定KCNN1的表达水平;用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱纯化裂解细胞上清中的KCNN1,并用Western印迹鉴定纯化结果。结果:KCNN1在Sf9细胞中高效表达,通过亲和层析获得了纯化的KCNN1。结论:膜蛋白KCCN1在昆虫细胞Sf9中的表达与纯化,为深入研究其分子生物学功能提供了材料,也为全长膜蛋白的体外表达提供了一套可借鉴的实验方法。     

利用杆状病毒表达幽门螺杆菌cagA基因

幽门螺杆菌cagA基因克隆到杆状病毒表达系统的pBlueBacHis2A转移载体中,将重组质粒pBlueBacHis2A-CagA与亲本病毒Bac-N-blue DNA共转染Sf9细胞,以空斑法纯化获得的重组杆状病毒.经PCR法鉴定后进行扩增培养,SDS-PAGE和Western bolt检测结果证实所表达的蛋白为CagA蛋白,间接ELISA分析表明,表达产物可与Hp感染者血清发生特异性的免疫反应.     

丙型肝炎病毒RNA多聚酶在昆虫细胞中的表达

HCV NS5B基因片段克隆入BAC-TO-BACTM重组杆状病毒表达系统的pFASTHTc载体质粒,转化DH10BACTM感受态细菌获得重组的Bacmid质粒,将重组Bacmid质粒转染Sf9细胞,获得的重组杆状病毒可表达目的蛋白.免疫印迹和体外活性检测表明,所表达蛋白为HCV NS5B蛋白,具有多聚酶活性.     

BJ46a基因在昆虫细胞的转染、蛋白表达及超微结构观察

目的研究蛇毒金属蛋白酶抑制剂BJ46a在杆状病毒表达系统的表达及宿主细胞Sf9超微结构的变化。方法将构建的杆状病毒重组穿梭载体Bacmid BJ46a,经Cellfectin脂质体介导转染Sf9昆虫细胞,获重组杆状病毒颗粒;以高滴度病毒感染Sf9昆虫细胞,行Western blot观察BJ46a融合蛋白的表达。在病毒扩增、蛋白表达过程应用透射电镜和超薄切片技术观察Sf9细胞超微结构的变化。结果Western blot分析表明：在转染病毒的Sf9细胞出现BJ46a融合蛋白表达条带。电镜观察表明：Sf9细胞在病毒扩增过程,细胞核增大,病毒发生基质形成,杆状病毒在其周围装配。蛋白表达期间,杆状病毒量剧增,细胞核内外存在大量丝状纤维。结论BJ46a基因可在杆状病毒表达系统成功表达,并伴随着宿主细胞超微结构的显著变化,其结果为杆状病毒表达系统的研究奠定坚实的基础。     

Expression of Rice Gall Dwarf Virus Outer Coat Protein Gene (S8) in Insect Cells

To obtain the P8 protein of Rice gall dwarf virus (RGDV) with biological activity,its outer coat protein gene S8 was expressed in Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells using the baculovirus expression system.The S8 gene was subcloned into the pFastBacTM1 vector,to produce the recombinant baculovirus transfer vector pFB-S8.After transformation,pFB-S8 was introduced into the competent cells (E.coli DH10Bac) containing a shuttle vector,Bacmid,generating the recombinant bacmid rbpFB-S8.After being infected b...     

利用昆虫-杆状病毒表达系统表达人乳头瘤病毒16/18/33/58亚型L1蛋白

目的:通过昆虫-杆状病毒表达系统获得人乳头瘤病毒(HPV)16/18/33/58亚型的主要衣壳蛋白L1。方法:克隆了HPV16/18/33/58亚型的L1蛋白基因,并采用密码子优化策略进行改造(记为HPV16/18/33/58亚型mL1),将优化基因片段插入pFastBac Dual载体获得重组载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞后得到重组Bacmid,转染昆虫Sf9细胞,Western印迹和SDS-PAGE检测重组蛋白的表达。结果:获得了表达HPV16/18/33/58亚型mL1蛋白的重组杆状病毒;Western印迹和SDS-PAGE分析表明该重组杆状病毒感染昆虫Sf9细胞后表达mL1蛋白,且mL1蛋白主要分布在细胞中;优化了蛋白表达时间和感染复数,获得目的蛋白mL1的高效表达。结论:多个亚型HPV L1蛋白的克隆表达,为中国优势血清型疫苗的研制奠定了基础。     

蛋白激酶D1催化结构域在昆虫细胞/杆状病毒表达系统内的表达、纯化和活性测定

蛋白激酶D(Protein kinase D,PKD)是一种新的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族和甘油二酯(Diacylglycerol,DAG)受体,参与细胞内多种生理生化过程。为获得高纯度的PKD1的催化结构域(PKD1-cat)用于晶体学结构的研究,将带有GST标签的PKD1-cat基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1中,构建了重组质粒。将重组质粒转化到含穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态细胞中,转座后获得了含目的基因GST-PKD1-cat的重组Bacmid。重组Bacmid DNA转染Sf9昆虫细胞后,获得重组杆状病毒并扩毒。将毒种以5 PFU/cell的感染复数感染悬浮培养的T.ni昆虫细胞,SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物。结果显示,表达产物在分子量约68 kDa处有一特异条带可与GST单克隆抗体发生反应。经谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析纯化和PreScission Protease切除GST标签后,得到了纯度很高的分子量约42 kDa的目的蛋白PKD1-cat。体外PKD激酶活性实验结果显示,随着PKD1-cat浓度的增加,激酶活性增高。这些结果显示截短的重组PKD1-cat有很高的催化活性和纯度,为采用核磁共振或晶体学方法解析PKD1-cat的三维结构奠定了基础。     

Expression of rice gall dwarf virus outer coat protein gene (<Emphasis Type="Italic">S8</Emphasis>) in insect cells

To obtain the P8 protein of Rice gall dwarf virus (RGDV) with biological activity, its outer coat protein gene S8 was expressed in Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells using the baculovirus expression system. The S8 gene was subcloned into the pFastBac™1 vector, to produce the recombinant baculovirus transfer vector pFB-S8. After transformation, pFB-S8 was introduced into the competent cells (E. coli DH10Bac) containing a shuttle vector, Bacmid, generating the recombinant bacmid rbpFB-S8. After being infected by recombinant baculovirus rvpFB-S8 at different multiplicities of infection, Sf9 cells were collected at different times and analyzed by SDS-PAGE, Western blotting and immunofluorescence microscopy. The expression level of the P8 protein was highest between 48–72 h after transfection of Sf9 cells. Immunofluorescence microscopy showed that P8 protein of RGDV formed punctate structures in the cytoplasm of Sf9 cells.     

SARS冠状病毒S蛋白在昆虫细胞中的表达和纯化

导致严重急性呼吸综合征(sevcre acute rcspiratory syndrome,SARS)的元凶是一种新型的冠状病毒(SARS coronavirus,SARS-CoV)。SARS-CoV感染入侵宿主细胞关键的一环是病毒自身的棘突蛋白(spike protein,S-protein)与细胞受体的相互作用,故而S蛋白己成为SARS研究的主要热点。     

丙型肝炎病毒RNA多聚酶在昆虫细胞中的表达

ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ基因片段克隆入ＢＡＣ－ＴＯ－ＢＡＣ＾ＴＭ重组杆状病毒表达系统的ｐＦＡＳＴＨＴｃ载体质粒,转化ＤＨ１０ＢＡＣ＾ＴＭ感受态细菌获得重组的Ｂａｃｍｉｄ质粒,将重组Ｂａｃｍｉｄ质粒转染Ｓｆ细胞,获得的重组杆状病毒可表达目的蛋白。免疫印迹和体外活性检测表明,所表达蛋白为ＨＣＶ ＮＳ５Ｂ蛋白,具有多聚酶活性。     

猪圆环病毒2型ORF2基因在昆虫细胞中的表达及其特性

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将圆环病毒2型的ORF2全基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBac^TM1中,获得重组转移载体pFast-OFR2,再将其转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,发生转座作用,经蓝白菌落筛选得到含ORF2基因的重组穿梭载体Bac-ORF2,以脂质体介导的方法将重组穿梭载体转染sf9细胞,获得重组病毒,命名为Ac-ORF2。间接免疫荧光分析表明,PCV2阳性血清能使Ac-ORF2感染的sf9昆虫细胞呈强的荧光着色; SDS-PAGE与Western-blotting分析可见大小约为28kD的特异性带,表明Ac.ORF2在sf9细胞中成功表达了PCV2-ORF2蛋白。将该表达蛋白纯化并经磷钨酸负染后,通过电镜观察可见形态与PCV2病毒粒子相似的病毒样颗粒(VLPs),其中某些颗粒由于中心浓染而似空衣壳,其直径也为17nm左右。     

利用杆状病毒Bac-to-Bac系统在Sf9细胞中表达真菌细胞色素P450nor

利用BactoBac杆状病毒载体表达系统将真菌细胞色素P450nor基因克隆至转移载体pFastBac1中, 得到重组质粒pFastBacP450nor, 再将其转化进入含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac中发生转座作用, 得到含P450nor基因的重组穿梭载体rBacmid pAcP450nor。分离提取重组Bacmid DNA, 并转染培养的昆虫细胞Sf9, 得到重组病毒rAcp450nor。经酶切和PCR 鉴定, 细胞色素P450nor基因正确地插入到病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下, SDSPAGE分析证明：表达蛋白的分子量为43kD左右。Western blotting分析结果表明：有一条特定的杂交带存在, 且分子量相同（约43kD）。进一步证明了含有真菌细胞色素P450nor基因的重组表达载体和重组病毒构建成功,并在昆虫细胞Sf9中实现了高效表达, 经MTT法测定表达的细胞色素P450nor具有还原NO的生物学活性。     

禽呼肠孤病毒σC基因在杆状病毒表达系统中的表达及其活性鉴定

本研究利用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建重组禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)σC基因的杆状病毒,感染sf9细胞获得表达重组蛋白。首先,将ARVσC基因克隆至pFastBacHTA载体,构建重组供体载体pFσC,将其转化大肠杆菌DHl0Bac感受态细胞,使σC基因整合到Bacmid穿梭载体中,获得重组穿梭载体BacmidσC。通过脂质体介导将其转染到sf9昆虫细胞中,获得重组杆状病毒rBacσC。通过Western Blot、间接免疫荧光试验(IFA)进行检测,结果显示:σC蛋白在重组杆状病毒rBacσC感染的sf9昆虫细胞中获得正确表达,分子质量约为37kD,表达的σC蛋白具有良好的反应活性。     

汉坦病毒H8205株G1P基因片段重组杆状病毒表达载体的构建及表达

将汉坦病毒H8205株G1P基因的保守序列(约1000bp)作为目的基因插入到BactoBac杆状病毒表达系统的pFastBacHTb供体质粒中,利用Tn7转座子同BacmidDNA同源重组,获得了含目的基因片段的重组杆状病毒DNA,并利用其转染Sf9昆虫细胞,72h后收集细胞悬液,再用该悬液侵染Sf9昆虫细胞,48h后收获病毒.采用IFA分析收获的产物,观察到了特异性的荧光,并且采用SDSPAGE和Western印迹也获得了与预期一致的结果.证明感染后的Sf9昆虫细胞所表达的蛋白中含有能与抗汉坦病毒H8205株多克隆抗体特异性结合目的蛋白.研究表明,采用杆状病毒表达系统可以成功表达出汉坦病毒H8205株包膜糖蛋白G1基因片段,为开发适合的以G1P为抗原的汉坦病毒诊断试剂进行了前期的探索.