不同材质微芯片内细胞生长状态分析

微系统技术在细胞生物学方面的研究中已得到广泛应用。了解细胞在微系统芯片内的生长状态，对于利用微系统技术进行细胞研究有重要的指导意义。玻璃和聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）是目前制作细胞培养微芯片的主要材料。通过向以二者为基底材料制作的细胞培养微芯片内导入内皮细胞进行培养，利用实验室构建的细胞成像分析系统观察和分析细胞在不同基底材料的芯片内5天的增殖情况，同时研究了基底材料的预处理方法以及培养基对细胞增殖的影响。     

用于药物筛选的微流控细胞阵列芯片

细胞区域分布培养以及如何有效地对微流体进行操控是微流控阵列芯片在细胞药物研究中的关键技术。本研究介绍了一种利用SU-8负性光刻胶模具和PDMS制作双层结构的微流控细胞阵列芯片的方法,该芯片通过C型的坝结构将进样细胞拦截在芯片的细胞培养的固定区域,键合双层PDMS构成阀控制层,阀网络的开关作用成功实现了芯片通道内微流体的操控,同时芯片设计了药物浓度梯度网络,产生6个不同浓度的药物刺激细胞。通过对芯片3种共培养细胞活性的检测和药物伊立替康(CTP-11)对肝癌细胞的浓度梯度刺激等实验结果验证该芯片在细胞研究和药物筛选等方面的可行性。     

SFRP4抑表达对HT-29细胞侵袭能力的影响

目的：观察SFRP4对HT29细胞侵袭转移能力的影响。方法：以HT29细胞为研究对象,SFRP4siRNA通过脂质体转染HT29细胞,westernblot检测HT29细胞中wnt、细胞核β—Catenin蛋白的表达、elisa法检测细胞培养上清MMP-2、MMP．9的含量,Transwell小室观察成的转移侵袭能力。结果：干扰SFRP4后能显著降低HT29细胞中Wnt、细胞核中B—Catenin蛋白的表达、细胞培养上清MMP-2、MMP-9的含量,（P〈0．01）,降低HT29细胞的转移侵袭能力（P〈0．01）。结论：抑制SFRP4表达能抑制HT29细胞的转移侵袭,其机制可能与抑制HT29细胞wnt信号通路有关。     

LO-2细胞上清诱导人脐血干细胞向类肝细胞分化

目的：探讨体外培养人脐血单个核细胞向类肝细胞的分化。方法：收集Lo-2细胞培养上清液加入培养基培养分离出的脐血单个核细胞,连续lOd检测甲胎蛋白（AFP）的表达情况,细胞传代后无诱导剂（LO-2细胞培养上清液）情况下检测白蛋白（ALB）表达情况。结果：培养6d后心P出现阳性结果,细胞传代后在无诱导剂的情况下AI卫检测阳性。结论：在L0-2细胞上清的诱导下,脐血单个核细胞能够分化为类肝细胞。     

一种基于EGFP的、安全的抗HIV药物评价系统

目的：建立基于EGFP的、安全的抗人免疫缺陷病毒（HIV）药物评价系统。方法：用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因替代HIV感染性克隆质粒pUC18-HIV-NL4-3中的部分包膜基因（env）,构建重组假病毒质粒pUC18-NL4-3-EGFP,将其与水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）真核表达载体共转染人胚肾293FT细胞,观察绿色荧光蛋白的表达,同时用该细胞培养上清进一步感染其他293FT细胞培养物。为了检验该假病毒系统能否用于抗病毒药物的评价,在假病毒复制和感染过程中加入不同浓度的抗HIV药物AZT（Zidovudine）,采用荧光显微镜检测和流式细胞仪定量检测,分析AZT对假病毒的抑制作用。结果：假病毒质粒pUC18-NL4-3-EGFP能够在转染细胞和再感染细胞中有效地表达绿色荧光蛋白基因,不同浓度的AZT能以剂量依赖方式抑制假病毒的感染和报告基因的表达。结论：建立了一种基于EGFP表达和检测的、安全的HIV假病毒复制和感染系统,该系统可以用于抗HIV药物的筛选和评价。     

ID1对大鼠C6细胞侵袭转移能力的影响

目的：观察IDl对大鼠胶质瘤细胞（c6细胞）侵袭转移能力的影响。方法：以C6细胞为研究对象,ID1 siRNA通过脂质体转染c6细胞,western blot检测C6细胞中ID1、P-NF—KBp65蛋白的表达、Elisa法检测细胞培养上清MMP．9的含量,Transwell小室观察成的转移侵袭能力。结果：干扰ID1后能显著降低C6细胞中P-NF-KBp65蛋白、细胞培养上清中MMP-9的含量（P〈0．01）,降低C6细胞的转移侵袭能力（P〈0．01）。结论：干扰ID1能抑制C6细胞的转移侵袭,其机制可能与抑制C6细胞中P-NF-K Bp65蛋白、MMP-9的表达有关。     

生物芯片检测细胞中microRNA的表达

目的：制备mieroRNA（miRNA）检测芯片,检测细胞中miRNA的表达。方法：将210个（206个miRNA,4个阳性对照）与已知人类和小鼠miRNA互补的序列作为探针,点干玻片上制备寡核苷酸芯片;提取肿瘤细胞（HeLa,MCF-7,A549,HT-29,ES-2,K562）的miRNA,用荧光染料Cy3标记,并与制备好的芯片杂交;用Sean Array^TM Express1．0扫描仪扫描荧光信号。采用SeanArray3．0和Cluster3．0软件分析处理扫描结果,并用RT—PCR方法对芯片检测结果进行验证。结果：建立了利用生物芯片检测miRNA表达的方法;发现不同细胞miRNA表达谱各异。结论：应用生物芯片技术检测细胞中miRNA的表达是可行的,可为研究miRNA的生理功能和作用机制奠定基础。     

微流控芯片电泳及其法医学应用

在光学性能良好的Brofloat玻璃电泳芯片上,利用自行搭建的共聚焦激光诱导荧光检测系统,通过对芯片管道表面修饰、筛分介质、分离电场强度、进样方式、电泳温度、进样时间等条件的优化,对含15个STR基因座的法医DNA样品进行电泳分离测试实验.通过对芯片电泳条件优化获得了本电泳系统的最佳条件,成功实现8 min内完成DNA样品片段的分离,表明该微流控芯片电泳系统在法医DNA快速分析方面具有良好的应用前景.     

细胞传感器与芯片的研究进展

细胞传感器（cell-based biosensor）与芯片(cell-based biochip)已成为后基因时代生物科学研究的重要工具,它们利用生活细胞作为研究对象或敏感元件,与传感器和芯片技术相结合,通过生物信号与物理、电化学等其他信号的转换,实现实时、快速、微量地检测细胞的功能信息和待测物的性质.在细胞生物学研究、环境监测和药物开发等领域有广泛的应用.综述近三年来细胞传感器与芯片技术的研究进展及应用,并提出展望.     

模拟微重力条件下对WB-F344肝干细胞表征分子表达的影响

研究大鼠WB-F344肝干细胞在旋转式细胞培养系统（RCCS）中培养进行细胞大规模扩增并保持干细胞的特性的可能性,为干细胞治疗疾病及肝组织工程提供理想的细胞来源。以WB-F344肝干细胞在RCCS中培养,以平面单层培养为对照,在培养后不同时间分别进行形态观察、流式细胞仪测细胞周期、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测肝干细胞特异性基因甲胎蛋白（AFP）和白蛋白（ALB）的表达, 免疫荧光染色检测 AFP、ALB蛋白的表达。结果表明,RCCS培养的WB-F344细胞粘附在Cytodex-3微载体上状态生长良好,细胞增殖较平面培养有明显增加;RT-PCR和免疫荧光染色检测结果一致：模拟微重力培养组AFP的mRNA表达强度及AFP阳性细胞均显著高于平面培养组,而ALB mRNA表达强度和ALB阳性细胞均低于对照组。说明模拟微重力 培养条件下,能较好的维持肝干细胞特性,进一步证明我们建立的这种培养体系是成功的,是一种理想的肝干细胞培养模式。     

嵌合中国分离株基因的丙型肝炎病毒（1b／2a）细胞培养模型的建立

目的：建立嵌合中国分离株基因的丙型肝炎病毒（HCV）细胞培养模型。方法：利用3片段融合PCR的方法将中国HCV河北分离株（1b）的全长包膜蛋白基因引入JFH1（2a）株基因骨架,构建包膜蛋白基因区相互置换的嵌合HCV（1b／2a）全长基因组,经线性化后体外转录获得全长RNA,转染Huh7．5．1细胞系,用免疫荧光及蛋白印迹实验检测。结果：该RNA可以产生具有体外感染活性的嵌合HCV,且感染性可在共同培养的细胞间传播。结论：首次在国内建立了嵌合中国HCV分离株基因的HCV细胞培养体系。     

乙型肝炎病毒假病毒体外感染树鼩原代肝细胞模型的建立

目的：建立乙型肝炎病毒假病毒（HBVpp）体外感染树鼩原代肝细胞（PTH）模型。方法：通过肝脏原位两步灌注法分离PTH并对其冻存方法进行优化,通过共转染293T细胞生产基于慢病毒包装系统的HBVpp并考察其感染的种属和组织特异性。结果：通过肝脏原位两步灌注法分离了PTH,并优化了PTH冻存液的配方;包装的HBVpp具有与HBV真病毒类似的感染种属和组织特异性。结论：该模型的建立对深化HBV进入肝细胞机制的研究具有重要意义。     

重组人内皮单核细胞活化多肽Ⅱ原对Saos-2细胞基因的表达调控

目的：将重组人内皮单核细胞活化多肽Ⅱ原（pro-EMAPⅡ）作用于Saos-2细胞,研究后者相关基因表达水平的变化。方法：在大肠杆菌中表达重组人pro-EMAPⅡ,并纯化获得目的蛋白;利用基因芯片技术研究重组人pro-EMAPⅡ对Saos-2细胞基因的表达调控。结果：获得重组人pro-EMAPⅡ;基因表达芯片分析表明,重组人pro-EMAPⅡ作用于Saos-2细胞后,后者有39个基因表达上调,29个基因表达下调,在这68个基因中有12个差异基因参与多个信号通路。结论：重组人pro-EMAPⅡ作用于Saos-2细胞,使其多个基因表达水平发生改变,有助于揭示pro-EMAPⅡ的调控机制及信号通路。     

离体子宫平滑肌测定方法的改进

目的:探索离体子宫平滑肌测定方法中,使用增氧泵通气取代混合氧为离体子宫平滑肌供氧的可行性。方法:采用RM-6240BD多道生理信号采集处理系统,观察营养液内通入混合氧、增氧泵通气及无通气对离体子宫平滑肌活动力的影响。结果:与营养液内通入混合氧相比,离体子宫平滑肌的活动力在混合氧组与增氧泵通气组间无统计学差异(P0.05),不通气组的频率和活动力均有统计学差异(P0.05或P0.01)。结论:可以使用增氧泵通气为离体子宫平滑肌供氧,既满足了供氧,同时也可促进营养液流动,使离体子宫与营养液充分接触。     

不同饲养层对鸡胚胎干细胞培养效果的影响

目的:为探索鸡胚胎干细胞培养的优化条件,比较不同饲养层对鸡胚胎干细胞离体培养的效果。方法:用传至第2代的鸡胚成纤维细胞与鸭胚成纤维细胞,经丝裂霉素处理后制作饲养层,比较这2种饲养层以及不用饲养层对鸡胚胎干细胞离体培养效果的影响。结果:在以鸡胚成纤维细胞和鸭胚成纤维细胞作为饲养层的培养体系中,鸡胚胎干细胞均可保持良好的生长状态,而且2种饲养层对鸡胚胎干细胞克隆形成的影响差异不显著(P0.05)。结论:鸡胚成纤维细胞和鸭胚成纤维细胞均可作为较好的饲养层细胞用于鸡胚胎干细胞的离体培养。     

无血清无饲养层培养体系在绵羊胚胎干细胞分离中的应用

目的：本文采用N2B27无血清无饲养层的完全已知成份的培养体系,通过机械分离法分离不同阶段的绵羊囊胚,观察不同阶段囊胚对分离绵羊类胚胎干细胞的影响。方法：本实验采用N2B27无血清无饲养层成份完全已知的培养体系,利用机械分离法对不同阶段的绵羊囊胚进行分离,观察其绵羊类胚胎干细胞的原代集落形成率,以及AKP 染色,多潜能性候选基因Oct-4 和Sox-2 免疫荧光检测。结果：分离早期阶段绵羊囊胚获得的绵羊类胚胎干细胞的形成率显著低于扩张（孵化）阶段囊胚（19.6%（11/56） vs 36.9%（31/84））（P ＜ 0.05）,同时早期和扩张（孵化）阶段绵羊囊胚的AKP 染色和多潜能性候选基因Oct-4、Sox-2 的表达呈阳性。结论：N2B27无血清无饲养层培养体系是一种有效分离绵羊类胚胎干细胞的培养基,同时分离绵羊扩张（孵化）阶段的囊胚可以显著的提高原代类胚胎干细胞的建系率,为提高绵羊类胚胎干细胞的建系奠定了基础。     

乙型脑炎病毒可视化分型基因芯片的制备

目的:制备乙型脑炎病毒(JEV)可视化分型基因芯片。方法:根据JEV的基因组序列,应用生物学软件设计JEV分型引物及探针,制备其可视化分型基因芯片;用生物素标记的引物PCR扩增目的片段,并与固定于玻片上的探针杂交,加入链霉亲和素标记的纳米金,银增强实现可视化;进行特异性、灵敏性及重复性试验。结果:探针特异地与相应的标记目的基因片段杂交,并在芯片上呈现较强的阳性杂交信号;2号探针能特异性检出JEV,3、4号探针可分别对Ⅰ型和Ⅲ型JEV进行分型;芯片对JEV质粒检测的灵敏度达105拷贝/mL;以蓝耳病病毒等5种病毒为对照,芯片只对JEV响应,具有特异性;制备的基因芯片具有批间、批内重复性。结论:制备的基因芯片具有高特异性、灵敏性及重复性,可以快速、准确、高通量地对JEV进行可视化分型检测。     

壳寡糖抑制脂多糖诱导的PIECs表达IL-8和VCAM-1作用的初步研究

目的：观察壳寡糖对脂多糖（LPS）诱导的猪髋动脉内皮细胞（PIECs）炎症损伤的影响以及潜在的分子机制。方法：以脂多糖（1g／mE）＊《激PIECs细胞,建立炎症损伤模型,以RT—PCR和Westernblot的方法观察壳寡糖（COS）预保护PIECs细胞24h,对白介素－8（IL－8）和血管细胞粘附分子．1（VCAM－1）表达水平的影响,以及对JNK信号蛋白磷酸化和c-Fos转录因子表达的影响。结果：壳寡糖可抑制脂多糖刺激的PIECs表达IL－8和VCAM－1,并抑制JNK信号通路的磷酸化和转录因子c-Fos的表达。结论：壳寡糖对脂多糖刺激的PIECs细胞中IL－8和VCAM—1表达的抑制作用是通过抑制上游的JNK信号通路磷酸化和转录因子c-Fos的表达实现的,从而缓解脂多糖对细胞造成的炎症损伤。     

应用基因芯片快速检测分枝杆菌

目的:将临床疑似分枝杆菌感染患者的标本用基因芯片方法进行分枝杆菌菌种鉴定,并将基因芯片检测的结果与传统的抗酸染色方法进行对比。方法:采用基因芯片PCR扩增、分子杂交、微阵列芯片扫描的方法检测379例临床疑似标本。结果:基因芯片阳性检出率为16.3%(62/379),涂片抗酸染色法阳性检出率为15.3%(58/379),两者差异无统计学意义(χ2=0.16,P>0.05);62例基因芯片检测阳性患者中有52例为结核分枝杆菌,另有10例为非结核分枝杆菌(其中3例偶然分枝杆菌,1例龟/脓肿分枝杆菌,1例堪萨斯分枝杆菌,4例浅黄分枝杆菌,1例海分枝杆菌)。结论:结合临床病例分析结果显示,基因芯片检测对鉴别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌分型具有快速、特异性高的特点,在分枝杆菌感染的早期诊断和治疗上具有重要的临床价值,值得推广和应用。     

小型猪骨髓间充质干细胞的分离和培养

目的建立小型猪骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的体外分离和培养方法。方法穿刺小型猪髂后上嵴抽取骨髓,经密度梯度法离心得到骨髓单个核细胞,接种后形成单层贴壁细胞。用形态学方法鉴定培养的MSCs。结果经培养存活的MSCs原代和一代呈纺锤型、多边型或星型。至二代起呈均一纺锤型,似成纤维细胞样,长宽比例约为（2～3）？1。体外培养的原代MSCs8～10d达到融合,传代后仍具有较强的增殖能力。结论小型猪MSCs可在体外长期、稳定培养,其分离、培养体系的建立为基础研究和组织工程技术提供了一个有价值的动物模型。