新疆家蚕抗菌肽基因突变及其抗菌活性的研究

为了改变抗菌肽的结构参数,探讨其结构与活性的关系,采用PCR扩增和人工合成基因的方法,对新疆家蚕抗菌肽基因进行改造及原核表达蛋白的抑菌活性研究.结果表明,α-螺旋、两亲性、疏水性、净正电荷数和关键氨基酸的替换等参数是相互依赖、相互影响,协同发挥作用,任何一个参数的改变都会影响抗菌肽整体的活性.α-螺旋是抗菌肽功能有效性的结构基础,但其所处的位置可能并不影响抗菌活性:两亲性结构是抗菌肽与生物膜相互作用的重要结构;疏水性程度必须保持在一定的范围内;在一定范围内增加多肽的阳离子能够增加抗菌活性,但正电荷数和抗菌活性之间无绝对正相关性;色氨酸的存在及抗菌肽的C-末端酰胺化能增强抗菌活性.     

利用亮氨酸和赖氨酸设计新型α-螺旋抗菌肽

【目的】根据螺旋轮模型设计以亮氨酸(L)为疏水面,赖氨酸(K)为亲水面的新型α-螺旋抗菌肽LK,并对该抗菌肽的生物学活性进行检测。【方法】利用圆二色光谱分析LK的二级结构,同时,评价LK的抑菌活性、稳定性和细胞选择性。【结果】在模拟细胞膜的环境中LK呈α-螺旋型结构。LK对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有很强的抑菌活性,最小抑菌浓度(MIC)在2-4μmol/L之间。LK具有很强的酸碱盐稳定性。肽浓度为2-4μmol/L时,LK表现出较低的溶血活性和细胞毒性。【结论】根据螺旋轮模型结构,以疏水性的L和正电荷性的K设计的新型抗菌肽LK具有较高的细胞选择性及稳定性,具有替代抗生素的发展潜力。     

一组人工合成抗菌肽的研究

Cecropin A1是一种从惜古比天蚕(Hyalophora cecropia)中提取的由37个氨基酸组成的一种α-螺旋抗菌肽,其杀菌活性较弱。本文采用了cecropin A1的N端1-8序列KWKLFKKI,另加一段标准的α-螺旋结构序列,然后用一个铰链结构GIG相连,合成了15条抗菌肽。经过试验证明部分含有核心标准螺旋结构的序列,对革兰氏阳性菌和阴性菌的最小抑菌浓度仅是原有cecropin A1抗菌肽的1/100左右。该类抗菌肽有希望进一步开发为新的抗感染药物。该类抗菌肽已经申请专利,专利号为PCT/CN 03/00522。     

鱼类抗菌肽的研究进展

鱼类抗菌肽是鱼体天然免疫的重要组成部分,其结构和组成复杂多样.根据生化和结构特点,可将它们分为4种基本类型：具有疏水或双亲性α螺旋结构的抗菌肽、含多对二硫键并可形成β折叠结构的抗菌肽、组蛋白样抗菌肽和具有糖基化修饰的抗菌肽.鱼类抗菌肽多以前肽原的形式合成,通过酶解切除信号肽和羧基端酸性片段后形成有活性的成熟肽.成熟肽具有很强的抑菌活性,其最小抑制浓度多在毫摩尔水平.目前,已克隆了多个鱼类抗菌肽基因,揭示了pleurocidin等基因家族的结构及其转录调控特点.鱼类抗菌肽的抗菌机制已建立了“桶-桶板”和“地毯”样两种模型,基本阐明了抗菌肽分子结构与抗菌功能间的关系.     

利用精氨酸和缬氨酸设计新型α-螺旋抗菌肽

摘要：【目的】抗菌肽是生命体的自身免疫系统的重要组成部分。其中两性的α-螺旋抗菌肽在抗菌肽家族中又占有重要的地位,发挥着重要的作用。为了得到具有更高抗菌活性同时具有很低细胞毒性的抗菌肽,根据α-螺旋二级结构衍生出来的螺旋轮模型,设计了一条在疏水一侧含有8个缬氨酸和亲水一侧含有5个精氨酸的新型16残基抗菌肽。【方法】测定了设计得到的新型抗菌肽的最小抑菌浓度、对于红细胞和哺乳动物肾细胞的细胞毒性以及杀菌动力学。 【结果】抗菌活性检测表明,新型抗菌肽VGR16显示了强并快速的杀菌作用,其最小抑菌浓度在16－64     

猪源抗菌肽PMAP-36的序列设计及其结构优化的研究进展

抗生素的耐药性和动物源性食品中的药物残留问题严重威胁全球公共卫生系统。因此,开发出不易产生耐药性、抗菌活性高的新型抗菌药物迫在眉睫。抗菌肽因其分子量小、抗菌谱广、不易产生耐药性等优点受到科学家们的广泛关注,但天然抗菌肽具有抗菌活性低、溶血活性和细胞毒性等缺陷。随着抗菌肽序列和结构的不断优化,多种具有显著体内外抗菌活性且安全高效的新型抗菌药物被研发出来。猪源抗菌肽PMAP-36是从猪骨髓细胞中分离出来的一种具有典型两亲性α-螺旋结构的高阳离子抗菌肽。本文就国内外关于猪源抗菌肽PMAP-36的序列设计及其结构优化等方面的研究进展进行综述。     

东北林蛙抗菌肽dybowskin-1ST的结构预测及生物学活性分析

运用生物信息学方法进行东北林蛙抗菌肽dybowskin-1ST的进化、结构及抗原表位预测,分析其抑菌机理及结构性质,应用小鼠伤口愈合实验及体外抑菌实验进行活性验证。同时为改良亲本肽、进行新型衍生肽的研发提供理论基础。使用软件MEGA_X对dybowskin-1ST及其他蛙类抗菌肽进行同源性比对并绘制系统进化树;通过在线软件ProtParam、ProtScale、PeptideCutter、SignalP、TMHMM Server分别预测抗菌肽dybowskin-1ST的理化参数、亲/疏水性、剪切位点、信号肽及跨膜区域;分别应用 SOPMA、Jpred4及DNAstar Protean软件多重分析预测dybowskin-1ST的二级结构,利用SWISS-MODEL和I-TASSER软件进行三级结构预测。通过在线软件ABCpred和SYFPEITHI进行T/B抗原表位预测。构建小鼠伤口模型,观察dybowskin-1ST促进伤口愈合活性。应用纸片法及96孔板法,确定dybowskin-1ST的抑菌活性。抗菌肽dybowskin-1ST含有59个氨基酸,其中亮氨酸占16.9%,分子式为C318H510N80O93S2,理论等电点为5.10,电荷量为?2。抗菌肽dybowskin-1ST与东北林蛙抗菌肽dybowskin-1CDYa亲缘较近。三种方法二级结构预测结果相似,dybowskin-1ST中α-螺旋、延伸链、β-转角、无规卷曲,所占比例分别为44.07%、16.95%、3.39%、35.39%。三级结构预测中显示该抗菌肽大部分为α-螺旋结构,抗菌肽dybowskin-1ST总体预测为亲水性蛋白,具有信号肽序列。亚细胞定位分析显示,其分泌线粒体靶向肽的可能性为0.944。该蛋白属于膜外蛋白,无跨膜结构区,有7个磷酸化位点,3个T细胞抗原表位和8个B细胞抗原表位。dybowskin-1ST具有促进伤口愈合的作用,能够有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌活性,但对真菌及耐药菌的抑菌活性有限。dybowskin-1ST结构中虽富含α-螺旋,但验证实验表明其抑菌能力仍有待加强,原因可能是由于其带负电荷且为亲水性蛋白,以提高正电荷数及改变疏水性为基本思路进行氨基酸改造可获得活性升级的衍生肽。     

SARS冠状病毒未知蛋白Orf 9b的克隆、表达和结构分析

从SARS病毒基因组中克隆Orf 9b基因并构建pET32-Orf 9b原核表达质粒,在原核细胞中表达目的重组蛋白并将其纯化,经肠激酶酶切后,得到分子量为11 kD的Orf 9b蛋白。ELISA检测表明重组Orf 9b蛋白可以与SARS康复病人血清反应而不与健康人血清反应。用圆二色光谱和红外光谱初步分析了重组Orf 9b蛋白的二级结构组成。圆二色光谱显示重组Orf 9b蛋白中α-螺旋占12.5%,β-折叠占40%,无规则卷曲占47.5%,红外光谱显示重组Orf 9b蛋白中α-螺旋占13.7%,β-折叠占47.5%,无规则卷曲占37.9%,两种检测方法对重组Orf 9b蛋白结构分析的结果基本一致,提示Orf 9b蛋白富含β折叠,而α-螺旋含量较少。获得该重组蛋白及对其结构的初步分析为进一步研究Orf 9b蛋白的功能奠定基础。     

沼水蛙抗菌肽brevinin-2GHa1分离纯化及结构分析

目前,已自青蛙皮肤分泌物中分离获得多种具有较强抗菌活性的多肽．本文利用电刺激法自沼水蛙背腺和耳后腺获得其皮肤分泌物,利用凝胶过滤色谱(Sephadex G-50)和反相高效液相色谱 (reverse-phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC)分离纯化,获得一种新型抗菌肽,命名为brevinin- 2GHa1. 抑菌实验显示,该抗菌肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制作用,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和沙门氏菌的最小抑制浓度分别为： 7.8、3.9、2.0 μg/mL和250.0 μg/mL. 该抗菌肽在水中为无规卷曲结构,在浓度为10 mmol/L SDS水溶液和不同浓度三氟乙醇水溶液中则呈α-螺旋结构,该抗菌肽结构的研究对阐明其抑菌机制具有重要作用.     

聚赖氨酸和它的溴化氢结合物结构变化的红外光谱研究

聚赖氨酸(PLys)和它的溴化氢结合物(PLys-HBr)在不同的相对湿度(R.H.)下,用红外光谱仪测得它们的结构变化.固态PLys-HBr(平均分子量(MW)55000)在40%R.H.以下能保持无规卷曲结构,在40—70%R.H.之间为β-折叠,70%R.H.以上为α-螺旋.PLys由于它们的平均分子量不同,结构变化差别较大.PLys(MW 55000)在各种相对湿度下保持α-螺旋,直至96%R.H.才出现β-折叠.PLys(MW 14000)在40%R.H.以下能保持无规卷曲结构,在40—85%R.H.之间主要为β-折叠,85%R.H.以上为α-螺旋.     

Prediction of Cell-Penetrating Peptides

Cell-penetrating peptides, CPPs, are used as delivery vectors for pharmacologically interesting substances, such as antisense oligonucleotides, proteins and peptides. We present a general principle for designing cell-penetrating peptides derived from naturally occurring proteins as well as from randomly generated polyamino acid sequences. Thereby, we introduce a novel pharmacological principle for identification of cell-penetrating peptides for which the applications can be numerous, including cellular transduction vectors and mimics of intracellular protein–protein interactions. The methods of identifying a CPP comprises assessing the averaged bulk property values of the defined sequence, and ensuring that they fall within the bulk property value interval obtained from the training set. Despite this simplistic approach, the search criteria proved useful for finding CPP properties in either proteins or random sequences. We have experimentally verified cell-penetrating properties of 10–20-mer peptides derived from naturally occurring proteins as well as from random poly-amino acids. We note that since CPPs can be found in part of the protein sequences that may govern protein interactions, it is possible to produce cell-penetrating protein agonists or antagonists.