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相似文献
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1.
利用PCR技术,从大肠杆菌C83902质粒中扩增出K88ac基因、ST1突变基因和LTB基因,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建了含K88ac-ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株BL21(DE3)(pXKST3LT5)。经酶切鉴定和DNA序列分析证实,构建的重组质粒pXKST3LT5中含有K88ac-ST1-LTB融合基因,且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测,重组菌株表达的K88ac-ST1-LTB融合蛋白能够被ST1单抗、LTB和K88ac抗体识别。经乳鼠灌胃试验证实,表达的融合蛋白已丧失天然ST1肠毒素的活性。免疫实验结果表明,K88ac-ST1-LTB融合蛋白能够诱发小白鼠产生抗体,该抗体具有中和天然ST1肠毒素的毒性作用,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪黄、白痢基因工程菌苗的候选菌株。  相似文献   

2.
大肠杆菌肠毒素ST1、LTB基因融合及其免疫原性研究   总被引:1,自引:1,他引:0  
目的:构建大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因,并研究其表达产物的免疫原性。方法:采用PCR和基因突变技术,从大肠杆菌C83902质粒中扩增ST1突变基因和LTB基因,通过基因分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建含ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株,并用酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒,同时用ST1-LTB融合蛋白粗提物免疫小鼠,观察免疫攻毒保护效果。结果:构建了含ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株BL21(DE3)(pXSL1),ST1-LTB融合基因的序列和阅读框架均正确,其表达的ST1-LTB融合蛋白能够被ST1单抗和LTB抗体识别,且该融合蛋白已丧失天然ST1肠毒素的活性。ST1-LTB融合蛋白能够诱发小鼠产生抗体,该抗体具有中和天然ST1肠毒素的毒性作用。结论:构建的重组菌株BL21(DE3)(pXSL1)可以高效表达ST1-LTB融合蛋白,其表达产物ST1-LTB融合蛋白具有良好的免疫原性,为更有效地预防仔猪黄痢提供了一种新型基因工程菌苗候选菌株。  相似文献   

3.
目的:对已构建的含有大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因的重组菌株进行鉴定和表达条件优化。方法:采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含ST1-LTB融合基因的重组质粒,同时用SDS-PAGE检测不同条件下ST1-LTB融合基因的表达情况。结果:酶切鉴定证实重组质粒pXSL1含有ST1-LTB融合基因且阅读框架正确,以IPTG为诱导剂诱导ST1-LTB融合基因表达的优化条件是:培养基pH7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时ST1-LTB融合蛋白表达量达35.2%。结论:实现ST1-LTB融合基因的高效表达,为大肠杆菌肠毒素双价基因工程菌苗的生产工艺研究提供了可靠的实验数据。  相似文献   

4.
用我室克隆的含大肠杆菌K88ac抗原基因的pMM031质粒和含肠毒素LT(A-B+)抗原基因的质粒pPMc4,使用限制性内切酶BamHI酶解,取得了K88ac抗原基因的片段,再经和BamH I消化的质粒pPmc4连接重组,构建了同时具有这两种抗原基因的质粒pMM085羟琼脂糖凝胶电泳分析,pMM085质粒的分子量约为14.6Md,在宿主菌E.CoilC600,经过ELISA和反向间接血凝等几种试验测定K88ac抗原,结果都说明其抗原产量与亲本菌株基本相同。重组菌的抗甘露糖豚鼠红细胞凝集反应也是阳性。对肠毒素抗原用被动溶血试验测定,结果说明其LT-B的产量和亲本菌的产量也基本相同。重组的工程菌株经兔肠结扎试验表明没有毒性反应,因此重组菌株可以作为预防仔猪腹泻的活菌疫苗候选株。  相似文献   

5.
C型产气荚膜梭菌α、β_1毒素基因的融合   总被引:3,自引:0,他引:3  
利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出α和β1毒素基因,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建了含αβ1融合基因表达质粒重组菌株BL21(DE3)(pETXAB1)。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实,构建的重组质粒pETXAB1含有αβ1融合基因,且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测,重组菌株表达的αβ1融合蛋白能够被α、β1毒素抗体识别。免疫实验结果表明,αβ1融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的C型产气荚膜梭菌C5944毒素攻击,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株。  相似文献   

6.
不耐热肠毒素(LT)和耐热肠毒素(ST)是产肠毒素大肠杆菌的主要致病因素,CS3为该菌的优势定居因子,是定居因子CFA/Ⅱ菌毛抗原的共有抗原组分。采用基因操作技术将编码CS3和融合肠毒素蛋白基因转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗侯选株X4072中进行表达。用重组菌株口服免疫小鼠后,免疫动物能产生抗CS3、LT和ST的血清抗体。特别有意义的是,所产生的抗ST抗体能中和天然ST的生物活性。这一结果为研究载体疫苗防治肠毒素大肠杆菌腹泻疾病奠定了基础。  相似文献   

7.
目的用重叠延伸PCR(overlap extension PCR)法获得人肠道病毒71型vp1与大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位(ltb)的融合基因,构建EV71 VP1-LTB融合表达质粒并在原核系统表达。方法设计14对引物通过重叠延伸PCR技术合成vp1基因,以ETEC(44815)质粒DNA为模板,PCR扩增ltb基因,将vp1基因与ltb基因连接并测序,连接产物插入原核表达质粒pBEX,构建重组质粒pBEX-VP1-LTB,转化E.coliB1221(DE3)进行表达,SDS-PAGE及W estern blotting分析其表达。电转法将重组质粒转入双歧杆菌。结果合成的vp1基因全长891 bp,测序结果与预期相符,重组表达质粒pBEX-VP1-LTB经PCR及双酶切鉴定,表明构建正确;目的蛋白在E.coliBL21(DE3)中获得了表达,Western bloting分析结果表明该蛋白具有与EV71 VP1抗体的反应原性;电转法成功将重组质粒转入双歧杆菌。结论应用重叠延伸PCR技术成功构建了EV71 VP1-LTB融合表达质粒,并在E.coliBL21(DE3)中获得有生物学功能的VP1表达产物,重组质粒双歧杆菌转化及VP1-LTB融合蛋白的表达研究,为研制EV71分子内佐剂疫苗打下了基础。  相似文献   

8.
C型产气荚膜梭菌β1、β2毒素基因的融合   总被引:8,自引:1,他引:7  
利用PCR技术 ,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出 β1 和 β2 毒素基因 ,构建了含 β1 - β2 融合基因表达质粒的重组菌株BL2 1(DE3) (pETXB1_2 )。经酶切鉴定和序列测定证实 ,构建的重组质粒pETXB1_2含有 β1 - β2 融合基因 ,且基因序列和阅读框架正确。经ELISA检测 ,重组菌株表达的 β1 - β2 融合蛋白能够被 β1 、β2 毒素抗体识别。免疫实验结果表明 ,用β1 - β2 融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗 1MLD的C型产气荚膜梭菌C5 9_4 4毒素攻击 ,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株。  相似文献   

9.
克隆毒素源性大肠杆菌K88ac抗原基因   总被引:3,自引:0,他引:3  
E.coli79-l454(08:K88ac K31:H-)是北京生物制品检定所从上海郊区腹泻的仔猪分离到的野生型毒素源性大肠杆菌,该菌产生K88ac抗原,产生热敏感毒素(LT)和热稳定毒素(sT)。发酵棉子糖,抗四环素,含有50Md的大质粒。用碱变性法提取,以线性cscl-EB密度梯度离心法纯化大质粒,用HindⅢ酶消化,回收6.5Md的片段,与载体pBR322连接,转化到E.coliRRl,选出Ap1Tc2的转化子,用玻片凝集,琼艚扩散。K88ac抗血清致敏的绵羊红细胞反向间接血凝,被动溶血,ELISA等方法检测K88ac抗原均为阳性的重组体,其中一株命名为E.coliRR1(pMM031),酶切图谱表明除含pBR322 DNA的片段外,还台有约为6.5Md的片段,此片段是HindⅢ酶消化大质粒DNA产生的第二条片段,含有为K88ac抗原基因编码的遗传决定子。用LT基因探针菌落原位杂交,Y—l肾细胞试验等方法检测结果表明重组体不产生LT;用乳鼠试验及STb基因探针杂交均是阴性,说明重组体不产生ST。由此可见重组体产生K88ac抗原,但无毒性,有可能用作疫苗栋,也可以与其他因子配伍构建成更好的活疫苗株。  相似文献   

10.
预防仔猪腹泻无抗性基因工程菌株的构建   总被引:6,自引:0,他引:6  
以原来含热不稳定肠毒素B亚单位基因质粒DNA为载体,插入lacZ基因,构建了一个既能表达LT-B亚单位又能表达B-半乳糖苷酶的含四环索抗性基因的重组体。在该重组DNA的四环素抗性基因内再插入K 88粘附因子抗原基因,从而灭活了四环素抗性基因。经测定该重组体能表达LT-B和K88两种抗原,lacZ基因取代四环素抗性基因,成为良好筛选标记。所构建的重组质粒能稳定存在。  相似文献   

11.
采用基因重组技术构建了表达产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的耐热肠毒素(ST)基因和热敏肠毒素B亚基(LT-B)基因融合抗原的疫苗候选株。将ST基因的5’端与LT-B基因的3’端连接,并置于同一阅读框。编码ST的基因是通过PCR从pSLM004质粒中扩增得到的,含有ST的pro序列(其编码ST前体的pro区域),并应用寡核苷酸定点突变技术将编码ST的第14位氨基酸残基发生突变,使ST的第14位氨基酸残基Ala突变为Leu。在所构建的结构中,于LT-B和proST之间分别插入了不同长度的氨基酸Linkers。表达的融合多肽同时具有ST和LT-B的抗原性,并保留结合GM-1神经节苷脂的能力,且无LT和ST的生物毒性。表达的融合蛋白免疫动物,能诱导产生相应的特异性抗体。  相似文献   

12.
产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是一种导致仔畜和婴儿腹泻的主要病原之一,它的毒力因子主要有两类:黏附素(CFAs)和耐热性肠毒素(ST)或不耐热性肠毒素(LT)。通过PCR技术及双酶切连接技术,成功构建了含有3个STI突变体和1个黏附素K99基因的重组表达质粒pE3S(S)LK和pE3S(G)LK。重组菌株BL21(DE3) (pE3S(S)LK)和BL21(DE3)(pE3S(G)LK)的表达产物经SDS-PAGE和免疫印迹分析,表明以上两种重组菌株均能高效表达3STI(S)-K99和3STI(G)-K99融合蛋白,且融合蛋白能够被产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922 抗血清特异性识别。其次,利用乳鼠灌胃实验检测重组蛋白的生物学毒性,结果均为阴性(G/C值≤0.083),这表明该菌株已无STI生物学毒性。这些为研发预防大肠杆菌性腹泻的新型高效多价基因工程疫苗提供了基本素材和理论指导。  相似文献   

13.
采用分子生物学技术构建了含有ST1-LTB-a-b融合基因的重组菌株BL21(DE3)(pETST3LTBab), SDS-PAGE和 Western blotting分析表明ST1-LTB-a-b融合基因在大肠杆菌中得到了高效表达, 融合蛋白分子量约为110 kD; 20 L发酵罐培养得到的最佳诱导条件为: 重组菌株以1%接种量、5 L/min通气量培养3 h后加终浓度为0.03 mol/L的乳糖诱导, 通气量升至12.5 L/min继续培养6 h, 表达量占菌体总蛋白的38.53%; 表达的ST1-LTB-a-b融合蛋白无毒性但具有免疫原性, 可以抵抗大肠杆菌和产气荚膜梭菌的感染; 构建的重组菌株BL21(DE3)(pETST3LTBab)有望作为预防仔猪腹泻基因工程疫苗的候选生产菌株。  相似文献   

14.
大肠杆菌肠毒素的基因融合及其免疫原性的研究   总被引:4,自引:0,他引:4  
应用重组基因工程技术,将热敏肠毒素B亚基(LT-B)基因与含有部分前体的耐热肠毒素(pro-ST)基因融合在一起,构建了表达LT-B/pro-ST融合蛋白的重组质粒.该融合蛋白不仅保持结合神经节苷脂(GM1)的能力,而且具有热敏肠毒素和耐热肠毒素的抗原性.乳鼠实验证明,融合蛋白虽然含有野生耐热肠毒素,但不具耐热肠毒素的生物毒性.腹腔免疫和鼻饲免疫均能激发产生抗ETEC两种肠毒素的抗体.  相似文献   

15.
将毒素原性大肠杆菌(ETEC)编码耐热肠毒素(ST)的基因片段与编码热敏肠毒素B亚基(LT—B)的基因进行融合,并在此基础上进行不同数目ST基因的串联。ELISA检测融合基因表达蛋白产物,观察到ST与LT-B之间存在着相互影响。ST的检测滴度随基因串联个数增加而逐渐升高,而LT的ELISA滴度则减弱。本研究说明ST可以通过基因串联提高表达产物抗原活性。这为毒素原性大肠杆菌多价疫苗的研制提供了重要的研究基础。  相似文献   

16.
大肠杆菌不耐热肠毒素的表达及其纯化保存策略   总被引:4,自引:0,他引:4  
编码完整大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)的基因被引入pET11c形成pET11-LT,该质粒在E.coli BL21(DE3)中得到较高效率的表达,约46mg/L。用D(+)Immobilized galactose柱可以在很宽的pH范围(pH7.3~10.4)内用多种方法对LT进行纯化且保持其结构完整。溶于TEAN(pH7.3)或碳酸盐缓冲液(pH10.4)的LT,冻干后保存于4℃,可长久保持其完整结构,此为保存LT的较好策略。与GM1结合实验、CHO细胞及Patentmouse毒性检测实验证明纯化的LT具有生物学活性。  相似文献   

17.
Aims:  To find out the prevalence of different serogroups of Escherichia coli ( E. coli ) and to detect heat-stable (ST) and heat-labile (LT) enterotoxin genes of enterotoxigenic E. coli (ETEC) from the faeces of mithun calves with diarrhoea.
Methods and Results:  Faecal samples obtained from 65 diarrhoeic mithun calves of under 2 months of age were examined for E. coli using polymerase chain reaction (PCR). Fifty-four E. coli isolates were obtained from those samples, which belonged to 38 different serogroups. Out of 54 isolates tested by PCR, two isolates (3·70%) belonging to serogroups O26 and O55 were found to possess gene that code for ST enterotoxin and one isolate (1·85%) belonging to serogroup O125 was found to carry LT enterotoxin gene.
Conclusions:  Escherichia coli isolates from diarrhoeic mithun calves were found to possess ST and LT enterotoxin genes, which are designated as ETEC, and these isolates can be detected through PCR using specific primers.
Significance and Impact of the Study:  This study reports the isolation of ETEC possessing ST and LT enterotoxin genes for the first time and ETEC could be a cause of diarrhoea in mithun calves leading to calf mortality.  相似文献   

18.
用基因工程方法,将金黄色葡萄球菌肠毒素 C2 与抗人表皮生长因子受体 HER-2 单链抗体 scFv-B1,以一连接短肽连接,构建融合免疫毒素 B-L-SEC2,并用改进的新型表达载体 pASK75-EX,在大肠杆菌 BL21(ED3)中表达. 以不溶性包涵体形式表达的目的蛋白经变性后以镍离子螯和层析纯化,并以透析法进行复性. 流式细胞术和 MTT 实验结果表明,纯化复性的融合免疫毒素 B-L-SEC2,在体外具有与 HER-2 过表达的靶细胞 SK-Br-3 特异性结合的活性,并对该细胞产生显著的特异性生长抑制作用.  相似文献   

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