两株真养产碱杆菌部分基因的克隆与序列分析

采用随机引物PCR技术从新建细胞培养室空气中获得两段长度414 bp及450 bp的片段.通过克隆测序及序列分析,结果表明,所测序列与真养产碱杆菌主要参考菌株的同源性分别高迭79%-83%及79%-84%,由其推导的氨基酸序列与真养产碱杆菌主要参考菌株的同源性高达86.4%-89.1%,由两分离菌株所获得基因片段推导的氨基酸序列之间的同源性高达98.1%,从而确定所分离两菌株为真养产碱杆菌不同亚型的菌株.     

真养产碱杆菌112R4酰亚胺酶基因的克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达

筛选到一株具海因水解活力的微生物,经鉴定后命名为真养产碱杆菌112R4。该菌能水解海因、二氢尿嘧啶和琥珀酰亚胺,且对琥珀酰亚胺活力最高,但不水解5单取代海因和5,5’双取代海因,因而被确定为含有酰亚胺酶。真养产碱杆菌112R4能在以琥珀酰亚胺为唯一碳、氮源的培养基上生长,表明该菌中存在琥珀酰亚胺完整的转化途径。从112R4基因组DNA出发,用鸟枪法克隆了一个6kb的与环酰亚胺水解相关的DNA片段;进一步亚克隆得到了带酰亚胺酶基因的2kb的DNA片段,并进行了序列测定。缺失分析确定了一个876bp的ORF为真养产碱杆菌112R4的酰亚胺酶基因,推测编码一个291个氨基酸的多肽,这是第一次报道微生物酰亚胺酶的核酸和蛋白序列。推测的氨基酸序列在蛋白数据库中进行了比较,结果表明,酰亚胺酶与已知的环酰胺酶没有明显的同源性,也不属于氨酰水解酶蛋白超家族,因而被分类为一种新的环酰胺酶。真养产碱杆菌112R4的酰亚胺酶与芽生杆菌A17p4的酰亚胺酶N端的20个氨基酸有较高的同源性,一致性为60%,与多糖脱乙酰酶保守序列也部分同源,一致性为14%。带有酰亚胺酶基因的重组质粒在大肠杆菌中得到表达,在lac启动子控制下,使用1mmol/L IPTG诱导5h,酰亚胺酶活力达到3200U/L,为供体菌真养产碱杆菌112R４的7倍。     

鸡传染性支气管炎病毒ZZ2004分离株3a、3b及E基因的序列测定与分析

采用随机引物PCR技术从具有腹泻、呼吸道症状及肾脏病变的肉鸡及无明显症状但生长迟缓的鸭体内获得一段长1171bp的片段,将此片段克隆入pMD18-T载体,测序后将序列用网上的BLAST软件和DNASTAR软件进行分析,结果表明所测序列与IBV主要参考毒株的同源率为82.0%-94.4%,与国内主要毒株CK/CH/LGD/04III、CK/CH/LGD/04II、chicken/JS/YZ07/2008、CK/CH/LSC/99I、SAIBK的同源率较高,达92.4%-94.4%,与国外毒株M41、H120、Beaudette、IBV4/91的同源性较低达85.2%-87.9%,从而确定所分离毒株ZZ2004为肾型传染性支气管炎病毒。     

一株转化淀粉或麦芽寡糖生成海藻糖的菌株D-97鉴定

由东北大田采集的土样中筛选到菌株D 97,该菌株胞内酶可以利用淀粉或麦芽寡糖合成海藻糖。通过生理、形态、结构特征分析及 1 6SrDNA基因全序列与参比菌株的序列比较 ,菌株D 97与食尼古丁节杆菌的 1 6SrDNA序列同源性高达 97 98% ,故将该菌株命名为食尼古丁节杆菌D 97(ArthrobacternicotinovorusD 97)。我们还将D 97菌株与日本林原公司的海藻糖生产菌———节杆菌Q36的有关生理生化特征进行了比较。     

phbB,phbC基因克隆,序列分析及植物表达载体的构建

利用聚合酶链式反应技术,从真养产碱杆菌Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ Ｈ１６染色体ＤＮＡ中的主增并克隆了调控聚－β－羧基丁酸生物合成的两个关键酶基因;依赖ＮＡＤＰＨ的乙酰乙酰ＣｏＡ还原酶基因和ＰＨＢ合成酶基因。限制性内切酶图谱和核苷酸序列分析证实了克隆结果,并表明所克隆的基因与国外报道的有很高的同源性。     

一株真养产碱杆菌增菌条件的研究

真养产碱杆菌能生产可降解性塑料聚-β-羟基丁酸(PHB)。对真养产碱杆菌的增菌培养条件进行了研究。通过正交实验得到最佳碳源组合配方,配方是:肉汤培养基基础上添加0.5%丁酸、0.5%酒精和4.0%甘露醇。48h培养结束后,细胞干重达3.891g/L。     

一株转化淀粉或麦芽寡糖生成海藻糖的菌株D-97鉴定

由东北大田采集的土样中筛选到菌株D-97,该菌株胞内酶可以利用淀粉或麦芽寡糖合成海藻糖。通过生理、形态、结构特征分析及16SrDNA基因全序列与参比菌株的序列比较,菌株D-97与食尼古丁节杆菌的16SrDNA序列同源性高达97．98％,故将该菌株命名为食尼古丁节杆菌D-97（Arthrobacter nicotinovorus D-97)。我们还将D-97菌株与日本林原公司的海藻糖生产苗——节杆菌Q36的有关生理生化特征进行了比较。     

副猪嗜血杆菌aroA基因鉴定及遗传进化分析

[目的]细菌aroA基因参与芳香族氨基酸的生物合成,被成功应用于细菌分类和基因失活致弱突变菌株的构建.副猪嗜血杆菌(Hps)是感染猪出现多发性浆膜炎和关节炎的一种病原细菌,鉴定该菌aroA全基因序列将有助于鉴定遗传进化关系和突变分析.[方法]利用PCR和细菌基因组步移技术鉴定Hps的aroA基因序列,进而对不同血清型菌株该基因序列进行鉴定,并与其它革兰氏阴性细菌进行比对和遗传进化分析.[结果]自Hps血清5型基因组DNA中获得包含完整aroA基因的3.7 kb基因片段,其中aroA基因全长1314 bp,编码产物长度437 aa,分子量大小47.9 kDa,该基因上游为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因.自本试验选择的Hps不同血清型菌株中均可扩增出包含完整aroA基因的1476 bp片段,且这些不同血清型菌株间核酸序列同源性在97.7%以上.Hps血清5型aroA基因序列与巴氏杆菌科其它成员核酸序列同源性为70.6%-78.9%,与E.coli和S.typhi-murium的同源性分别为66.4%和67.2%.[结论]本试验首次对Hps的15个血清型国际参考菌株及地方分离株aroA全基因序列进行了鉴定,序列比较结果显示aroA基因在革兰氏阴性细菌中具有较高的同源性.aroA基因鉴定对构建基因失活突变菌株以研究Hps生物学特性奠定了基础.     

拮抗菌株Kc-t99的鉴定及其抑菌活性研究

通过传统分类与分子生物学技术相结合的方法对从京郊菜园土壤中分离筛选的拮抗菌株Kc-t99进行鉴定,并采用生物测定的方法评价其抑菌活性.结果表明,菌株Kc-t99的形态学特征和生理生化特性与枯草芽孢杆菌基本一致,其16S rDNA序列与GenBank中已鉴定的枯草芽孢杆菌的16S rDNA序列同源性高达98.06%,据此初步确定其为枯草芽孢杆菌.抑菌试验表明该菌株对供试的5种病原真菌和4种细菌均具抑菌活性,其中对甘蓝枯萎病菌、黄瓜角斑病菌和桃褐腐病菌抑制作用显著.     

内蒙古碱湖中紫色非硫光合细菌的分离和鉴定

从内蒙古碱湖水样中分离得到一株紫色非硫光合细菌,命名为JH1-6.对该菌株进行了形态学观察、生理生化鉴定、活细胞吸收光谱以及16S rDNA序列分析.16S rDNA序列分析结果表明该菌株与沼泽红假单胞菌的16S rDNA序列同源性高达99%,结合形态特征和生理生化特性以及活细胞吸收光谱特征等,确定菌株JH1- 6在分类地位上属于沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris).     

禾谷镰孢菌α-微管蛋白基因克隆及其与多菌灵抗药性关系分析

根据禾谷镰孢菌参考菌株NRRL310 84 (PH 1)的α- 微管蛋白基因核苷酸序列设计 4对引物 ,采用PCR方法克隆并测序了禾谷镰孢菌 (Fusariumgraminearum)对多菌灵 (MBC)不同敏感性表型的 6个中国菌株的α 微管蛋白基因全序列。DNA序列对照表明中国的 3个敏感菌株和 3个抗药菌株的α- 微管蛋白基因核苷酸序列同源性没有差异 ,多菌灵抗药性与α- 微管蛋白无关。该基因全长 1718bp ,含有 6个内元 ,编码 4 4 9aa ;与NRRL310 84的α- 微管蛋白基因核苷酸序列同源性为 99% ,存在 5个差异核苷酸 ,与其所编码的氨基酸序列同源性为 99 78% ;与其他 6种真菌α- 微管蛋白基因所编码的氨基酸序列同源性为 37%～ 86 %。     

芦花鸡中B亚群禽白血病病毒的分离与鉴定

通过接种DF-1细胞(C/E)系,从山东某地方品系芦花鸡的鸡群中分离到一株外源性白血病病毒(ALV)SDAU09C2。与GenBank中已发表的不同亚群鸡ALV参考株的囊膜蛋白gp85的氨基酸序列比较,表明该分离株与B亚群ALV(ALV-B)2个参考株的gp85的氨基酸同源性最高,均为92.5%;与A、C、D、E亚群ALV的gp85的氨基酸同源性仅在73.2%~87.9%之间;而与J亚群gp85的氨基酸同源性更低至30.3%~32.4%。这是我国地方品系鸡群中第一次分离和鉴定ALV-B及其gp85基因的报道。     

Isolation and Characterization of New Cyclohexylacetic Acid-Degrading Bacteria

Six cyclohexylacetic acid-degrading strains were isolated from soil samples in Japan and identified as members of the genera Cupriavidus (strain KUA-1), Rhodococcus, and Dietzia by 16S rRNA gene sequence analysis. For the first time members of these genera were shown to be capable of degrading cyclohexylacetic acid. A selected strain, KUA-1, which is the first reported Gram-negative organism capable of growth on cyclohexylacetic acid, was identified as a Cupriavidus metallidurans, based on morphologic and physiologic characteristics and its 16S rRNA gene sequence. Metabolite analysis by HPLC-MS indicated that 1-cyclohexenylacetic acid is an intermediate of cyclohexaneacetic acid metabolism in strain KUA-1.     

Insertion sequence elements in Cupriavidus metallidurans CH34: distribution and role in adaptation

Cupriavidus metallidurans CH34 is a β-proteobacterium well equipped to cope with harsh environmental conditions such as heavy metal pollution. The strain carries two megaplasmids specialized in the response to heavy metals and a considerable number of genomic islands, transposons and insertion sequence (IS) elements. The latter were characterized in detail in this study, which revealed nine new IS elements totaling to 21 distinct IS elements from 10 different IS families and reaching a total of 57 intact IS copies in CH34. Analysis of all fully sequenced bacterial genomes revealed that relatives of these IS elements were mostly found in the Burkholderiaceae family (β-proteobacteria) to which C. metallidurans belongs. Three IS elements were 100% conserved in other bacteria suggesting recent interaction and horizontal transfer between these strains. In addition, a number of these IS elements were associated with genomic islands, gene inactivation or rearrangements that alter the autotrophic growth capacities of CH34. The latter rearrangements gave the first molecular evidence for the mutator phenotype that is characteristic for various C. metallidurans strains. Furthermore, differential expression of some IS elements (or adjacent genes in the same strand orientation) was found under heavy metal stress, an environmental stress to which C. metallidurans CH34 is well adapted. These observations indicate that these IS elements play an active role in C. metallidurans CH34 lifestyle, including its metabolic potential and adaptation under selective pressure.     

马铃薯X病毒湖南分离物的鉴定与分组研究

从湖南石门采集表现重花叶症状的马铃薯叶片中分离纯化到一株线状病毒HN021。经双链RNA(ds—RNA)抽提、寄主反应测定、病毒粒子和内含体的形状观察,初步确定该病毒为马铃薯X病毒(Potato virus X)。以ds—RNA作为模板,用相应引物对HN021分离物的ORF4-UTR-ORF5片段进行RT—PCRP得到1kb左右的双链cDNA片段。对该片段进行克隆和测序,并将测序所得的核苷酸序列与Genbank(登录的11株不同分离物的相应片段的核苷酸序列进行同源性比较和分析。结果表明,HN021与分离自南美洲的三株分离物(COAT,KPA和HB)的同源性为78．4％—79．4％,与其它8株(分离自亚洲、欧洲、大洋洲和北美洲)分离物的同源性为96．4％—97．8％。从氨基酸水平比较,HN021与COAT,KPA和HB三者CP和8kDa蛋白氨基酸序列同源性分别为86．5％—89．0％和74．3％—75．7％,相应地与其它8株分离物的同源性分别为97．1％—98．7％和97．1％—100％。序列分析的结果证实了HN021分离物为马铃薯X病毒,同时表明PVX明显存在两个组(组Ⅰ和组Ⅱ),HN021和其它来自亚洲、欧洲、大洋洲、北美洲分离物的组Ⅱ,3个南美洲分离物属于组Ⅰ。     

庚型肝炎病毒—中国河北分离株部分NS3区基因序列分析

在急慢性输血后肝炎、散发性肝炎及爆发型肝炎中,大约１０～２０％的病人不属于已发现的Ａ～Ｅ型肝炎,提示存在新型肝炎病毒。在美国１９９５年第４６届医学年会上,已有了一些有关庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）分子生物学及庚型肝炎血清学方面的摘要报道。１９９６年初Ｌｉｎ...     

麻疹病毒S191疫苗株N基因稳定性研究及免疫细胞表位分析

研究麻疹病毒(Measles virus,MeV)疫苗株S191毒种和传代病毒核蛋白(Nucleoprotein,N)基因稳定性及其遗传与变异特点;对该序列一些重要位点的氨基酸进行比较,探讨其功能结构及生物学活性变化以及S191疫苗株的保护效果。利用RT-PCR方法扩增S191减毒株23、26、27、29、32、37不同代次N基因,测序进行比对分析。S191传代病毒N基因序列之间核苷酸同源性99.7%~100%,氨基酸同源性为99.6%~100%;S191株与7个疫苗株之间核苷酸序列同源性达99.1%~99.4%;S191和中国流行代表株序列同源性在95.0%~95.4%;S191与世界流行代表株同源性达94.7%~99.4%;S191疫苗株和中国流行代表株CHN93/7(H1a)的4个重要T细胞表位氨基酸保持一致。S191各传代病毒基因具有较高稳定性,该疫苗有一定的保护作用。     

二株B亚群禽白血病病毒全基因组序列及其在细胞上的复制性比较

本研究比较了从山东地方品系鸡群分离到的二株B亚型禽白血病病毒(ALV)SDAU09E3和SDAU09C2的全基因组序列及它们在细胞培养上的复制动态。这二株ALV-B的同源性为95.4%,与GenBank中3株B亚群参考株之间的同源性也均在91.0%～94.9%间,而与其它亚群参考株的同源性均低于87.9%。与亚群无关的gag、pol基因和LTR的核苷酸序列比较表明,这二株ALV-Bgp85基因的gag和pol基因与所有比较的参考株的同源性均在93%以上。LTR与其他外源性ALV参考株的LTR间的同源性在72.6%～88.3%范围内,但与E亚群内源性ALV的LTR的同源性只有51.5%。然而,这二个ALV-B的LTR的同源性也只有74.8%,远低于其他基因组部分的同源性,特别是它们的LTR的U3区同源性只有68.8%,二者在二个CAAT分布上也显著不同。对这二株ALV-B在DF-1细胞上的复制动态比较表明,它们在细胞培养上清液中的TCID50值非常类似,但SDAU09E3株核衣壳蛋白p27抗原的含量显著高于SDAU09C2株。这表明,同一亚群的不同毒株在复制过程中,所表达的p27抗原量与所形成的具有传染性的病毒量间没有平行关系。这一差异与LTR-U3区的相关性则有待应用感染性克隆技术来做进一步深入研究。