人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的体外分子进化

以人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的5株CDR3突变体为基础,利用致错PCR和DNA重排方法对其进行了突变和重排,然后克隆重组装的突变单链抗体至载体pHB-1HSCFV而构建了库容为10^5的抗体库,利用噬菌体表面呈现技术对构建的人源化抗体突变库进行了富集,并利用单链抗体-碱性磷酸酶系统进行了阳性克隆的筛选和鉴定。随后以鉴定的5株阳性克隆为基础进行了第二轮的致错PCR、DNA重排、抗体库的构建和富集,并筛选到4株亲和力较亲本鼠抗体All更好的人源化抗体,该研究为研制低免疫原性的导向溶栓制奠定基础。     

鼠抗人纤维蛋白抗体单链Fv片段的人源化分子设计

产生免疫原性的残基都是位于蛋白表面的暴露残基,为了消除鼠抗体对人的免疫原性,利用表面再塑方法对本室克隆的鼠抗人纤维蛋白抗体单链Fv片断进行了人源化分子设计。首先确定了鼠及人Fv表面残基,在此基础上分析了鼠与人Fv间表面残基的差异,将有差异的鼠表面残基换成人的。提出了残基最高频率人源化及最相似链人源化两种人源化方案。人源化后鼠抗人纤维蛋白抗体单链Fv的结构经Profile-3D验证是合理的,置换的表面残基溶液可及性未变,且未影响CDRs的结构,应不会影响与纤维蛋白的亲和力,为鼠抗体人源化实验研究奠定了基础。     

鼠抗人纤维蛋白抗体单链Fv片段的人源化分子设计

产生免疫原性的残基主要是位于蛋白表面的暴露残基,为了消除鼠抗体对人的免疫原性,利用表面再塑的方法对本室克隆的鼠抗人纤维蛋白抗体单链Ｆｖ片段进行了人源化分子设计．首先确定了鼠及人Ｆｖ片段的表面残基,在此基础上分析了鼠与人抗体Ｆｖ片段表面残基的差异,将存在差异的鼠抗体的表面残基换成人的,从而实现鼠抗体的人源化．提出了残基最高频率人源化及最相似链人源化两种分子设计方案．人源化的鼠抗人纤维蛋白抗体单链Ｆｖ片段的结构经Ｐｒｏｆｉｌｅｓ－３Ｄ检测证明合理,替换的表面残基的溶剂可及性未变,而且未对ＣＤＲｓ的空间构象产生明显影响,应不会影响与纤维蛋白的亲和力,为鼠抗体人源化实验研究奠定了基础．     

两种人源化单链抗体-尿激酶融合基因的构建与表达

Ｓｃｕ ＰＡ 32Ｋ是单链尿激酶 (Ｓｃｕ ＰＡ)分子的Ｎ端肽段被水解后的产物 ,其分子量小但具有与Ｓｃｕ ＰＡ相同的体内外生物活性[1] 。在过去的工作中 ,本实验室利用噬菌体表面呈现技术筛选到 1株对人纤维蛋白特异的鼠源单链抗体[2 ] ,并构建了鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体—Ｓｃｕ ＰＡ 32Ｋ融合基因。为解决该融合基因在大肠杆菌中的高表达问题 ,通过在大肠杆菌中表达构建的一系列融合基因的缺失突变体 ,初步认定Ｓｃｕ ＰＡ 32Ｋ基因中两个连排的大肠杆菌稀有密码子ＡＧＧ(精氨酸 )是影响该融合基因表达的主要因素。用ＰＣＲ定位诱变法…     

人源抗A型肉毒毒素单链抗体的体外亲和筛选

以重组制备的A型肉毒毒素保护性抗原为配体,对人源噬菌体免疫抗体文库进行体外定向亲和筛选,获得特异结合子,其中与抗原高亲和力结合的抗体克隆B17基因全长750bp,可编码250个氨基酸,抗体可变区基因同源分析表明,分属VH4和κ chain Ⅱ家族,是一株人源特异单链抗体基因。人源单链抗体B17在大肠杆菌中获得了重组表达,表达产物可以竞争特异肉毒抗毒素马血清与抗原的结合,是国内首次获得的抗A型肉毒毒素保护性抗原的人源单链抗体,可以在肉毒毒素检测和治疗研究中发挥作用。     

人源抗A型肉毒毒素单链抗体的体外亲和筛选*

以重组制备的A型肉毒毒素保护性抗原为配体,对人源噬菌体免疫抗体文库进行体外定向亲和筛选,获得特异结合子,其中与抗原高亲和力结合的抗体克隆B17基因全长750bp,可编码250个氨基酸,抗体可变区基因同源分析表明,分属VH4和κchainⅡ家族,是一株人源特异单链抗体基因。人源单链抗体B17在大肠杆菌中获得了重组表达,表达产物可以竞争特异肉毒抗毒素马血清与抗原的结合,是国内首次获得的抗A型肉毒毒素保护性抗原的人源单链抗体,可以在肉毒毒素检测和治疗研究中发挥作用。     

Ⅳ型胶原酶人基因工程抗体的研制

肿瘤组织内Ⅳ型胶原酶表达和活性升高与肿瘤转移密切相关 .抑制Ⅳ型胶原酶活性的物质能够有效地抑制或降低肿瘤的转移 .因此Ⅳ型胶原酶已成为恶性肿瘤辅助诊断和控制癌转移的标志分子之一 .利用噬菌体抗体展示技术 ,在人抗体库研究的基础上 ,成功地研制出一种Ⅳ型胶原酶特异人源单链抗体hCo4.该抗体主要是由抗体轻链可变区和重链可变区组成 ,分子量约为 2 7ku .ELISA和免疫印迹均证明hCo4能够与Ⅳ型胶原酶特异结合 ,是目前所报道的Ⅳ型胶原酶特异抗体中分子量最小的人基因工程抗体 .该抗体的亲和力与从分泌抗Ⅳ型胶原酶单抗的杂交瘤细胞制备的鼠源单链抗体亲和力相同 .它有可能成为一种研究Ⅳ型胶原酶与肿瘤转移相互关系的工具以及用于肿瘤免疫诊断和治疗 .     

肝癌特异性鼠源及人源化单链抗体基因的克隆与表达

为探讨肝癌特异性鼠源及其人源化单链抗体基因的表达策略并比较二者的结合能力,在3种载体中分别以融合、分泌及胞内表达的方式进行了研究;对复性后的单链抗体以抗原捕获ELISA法进行检测。结果表明,在3种载体中表达的鼠源及人源化单链抗体都是包含体,诱导物浓度及培养温度不影响表达形式;抗原捕获细胞ELISA表明人源化的单链抗体和鼠源单链抗体有相近的抗原结合能力。结论是:在大肠杆菌中表达的基因工程单链抗体的可溶性可能主要由自身氨基酸一级序列决定;先前的设计所采取的人源化方案没有影响到鼠源抗体的CDRs的天然构象,表达的人源化单链抗体提供了免疫原性评价及临床应用的基础。     

低分子量单链尿激酶与血纤蛋白粘附肽融合基因的构建、表达及产物活性分析

低分子量单链尿激酶(scu-PA-32)可通过激活纤溶酶原转变成纤溶酶溶解血栓,其溶栓具有一定的选择性,出血副作用比双链尿激酶小,但缺少对纤维蛋白的特异亲和力;2种血纤蛋白粘附肽(四肽A4;十二肽A12)都可和纤维蛋白特异性地结合,具有抗纤维蛋白单体聚合的功能,并因此有一定的抗血栓形成作用。本研     

血管内皮生长因子特异性鼠源单链抗体的人源化

以抗体阻断血管生成信号来治疗实体肿瘤显示了很好的前景,但鼠源抗体首先必须经人源化改造以降低其免疫原性才能应用于人体。本研究以同源模建预测了一体人血管内皮生长因子（VEGF）特异性鼠源单链抗体E11的三维结构,以结构数据为基础并采取单个最相似框架区替代法对其进行人源化设计;合成并组装了人源化单链抗体基因并在大肠杆菌中表达,包含体形式的产物以凝胶柱色谱法复性,经ELISA检测表明,人源化后的单链抗体保持了与天然VEGF结合的活性,表明采取的人源化路线具有可行性。     

重组单链抗体-低分子质量尿激酶融合蛋白在 CHO 细胞中的抗降解研究

抗人纤维蛋白单链抗体-低分子质量尿激酶(Ⅱn-UK)融合蛋白,兼有单链抗体对纤维蛋白的亲和性和尿激酶的溶栓活性,有望开发成为新型导向溶栓药物.但基于通用连接肽(G4S)3的Ⅱn-linker-UK融合蛋白在CHO细胞中表达时出现明显的降解.为了解决此问题,利用分子生物学方法,对Hn-UK融合蛋白进行了分子改造,包括置换连接肽,改变两个半分子(moiety)的相对位置,以及对连接肽附近明确的蛋白酶位点进行突变等方法,并分别研究了改造后的11种Ⅱn-1inker-UK或UK-linker-Ⅱn突变体在CHO细胞中分泌性表达时的稳定性,最终筛选到一种抗降解的突变体.     

一种新型融合蛋白(RGD)3/tTF的基因表达与活性分析

为了发展一种新型的融合蛋白(RGD)3/tTF用于肿瘤血管的选择性栓塞治疗,利用PCR技术重组(RGD)3/tTF融合基因,克隆于pET22b( )载体,表达于E.coliBL21(DE3)。用镍柱纯化融合蛋白。凝血实验与FⅩ活化实验检测融合蛋白tTF组分的活性。间接ELISA分析(RGD)3/tTF与αvβ3的特异结合能力。pET22b( )/(RGD)3/tTF重组质粒成功获得并表达于E.coliBL21(DE3)。纯化蛋白(RGD)3/tTF能有效诱发血液凝固,活化FⅩ。(RGD)3/tTF与αvβ3的特异结合能力比RGD/tTF提高了32%。新型融合蛋白(RGD)3/tTF已在E.coli系统成功表达,表达蛋白保持tTF的活性并显示比RGD/tTF更高的与αvβ3的结合能力。     

RGD肽与尿激酶B链融合蛋白原核重组表达质粒的构建,表达和？…

将化学合成的ＲＧＤ肽（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）编码寡核苷酸与尿激酶Ｂ链ｃＤＮＡ相连成为融合基因后,克隆至原核表达质粒ｐＢＶ２２０中,在ＰＲＰＬ自动子的作用下,经４２℃热诱导,在大肠杆菌ＤＨ５α中获得了融合基因的表达,其表达量占菌体总蛋白的９．２％,表达产物以无活性的包含体形式存在。经变复性处理得到纯化的融合基因的表达产物,经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析表明产物具有与天然尿激酶相似的抗原性,     

Expression of functional scorpion neurotoxin Lqq-V in E.coli

We report the results on the expression in Escherichia coli of a functional neurotoxin LqqV from the scorpion Leiurus quinquestriatus quinquestriatus. The gene for LqqV was synthesized using recursive PCR and expressed as a poly-histidine-tagged fusion protein in thioredoxin mutant E. coli strain [AD494(DE3)pLysS], thus permitting disulfide-bond formation. When cultured at 37 degrees C, about 50% of the expressed protein is contained as a monomer in the soluble fraction of the E. coli extract. The fusion protein from the soluble fraction was purified and the His-tag was cleaved by thrombin, resulting in a yield of about 1.5 mg/liter. The globular structure of the purified protein was confirmed by NMR and CD spectroscopy. Patch-clamp measurements using native sodium channels in guinea pig ventricular myocytes reveal (1) a slowing of inactivation and (2) a decrease in peak current upon application of toxin, thus confirming the alpha-toxin activity of the purified recombinant protein.     

ATF-PAI2CD融合蛋白的生物学功能

为了解尿激酶型纤溶酶激活物 (urokinase typeplaminogenactivator,uPA)的氨基末端片段 (amino terminalfrag ment,ATF)和纤溶酶激活物抑制剂 2 (plasminogenactivatorinhibitortype 2 ,PAI 2 )突变体PAI 2CD融合蛋白在大肠杆菌的表达情况及进一步研究其生物学活性、将ATF PAI2CD融合基因与大肠杆菌表达载体pLY 4重组得到表达质粒pZWE ATF PAI2CD ,以其转化大肠杆菌JF112 5 ,经温度诱导 ,ATF PAI2CD获得较高水平表达 ,融合蛋白质以包涵体形式存在 ,占菌体总蛋白质的 15 %。包涵体经洗涤、8mol L尿素溶解、稀释复性及离子交换色谱一步分离 ,纯度达 90 % ,分子量与理论值相符。每升发酵液得重组融合蛋白质 5 0mg。经牛奶板法检测具有纤溶抑制活性 ,比活性达 12 0 0 0IU mg ;应用放射竞争法证实融合蛋白质能与肿瘤细胞表面的uPA受体特异性结合。双功能融合蛋白质的纤溶抑制活性与野生型PAI 2 (或PAI 2突变体 ,PAI 2CD)基本一致 ,与肿瘤细胞表面的uPA受体的结合能力同pro uPA。     

抗人肿瘤坏死因子-α单链抗体与其配体的相互作用

为了在大肠杆菌中表达纯化抗人 TNF- α单链抗体并检测其结合活性与中和活性 .利用GST融合蛋白系统在大肠杆菌中表达抗人 TNF- α单链抗体 E6Sc Fv;分离包含体后进行变性和复性 ,再用亲和层析法进行纯化 ;用 ELISA法和酵母双杂交系统检测 E6Sc Fv与配体的结合 ;用 L92 9细胞检测 E6Sc Fv对人 TNF- α细胞毒作用的中和活性 .经变性 ,复性与亲和层析 ,E6Sc Fv被纯化 ,在 SDS- PAGE上为单一蛋白带 ;体外结合与中和实验表明 ,表达纯化的 E6Sc Fv可与人 TNF-α结合并中和其细胞毒活性 ;进一步用酵母双杂交系统证明当表达于细胞内时 ,E6Sc Fv仍保持了与TNF-α相结合的能力 .     

产肠毒素大肠埃希菌CfaB亚单位的免疫原性分析

目的表达并纯化产肠毒素大肠埃希菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）CFA／I定居因子的CfaB亚单位,分析其免疫原性。方法将不含信号肽序列的cfaB基因克隆到pQE一30上,构建重组质粒pQE-30-cfaB并转化EcoliM15,表达融合蛋白6xHis—CfaB,将表达的蛋白纯化和复性后免疫BALB／c小鼠,制备抗CfaB的抗血清,用ELISA法检测抗血清效价。结果6×His—CfaB融合蛋白高效表达,相对分子质量为15．5kD,纯化复性后免疫小鼠所得抗血清效价为1：125000。结论成功构建了高效表达6×His-CfaB融合蛋白的重组质粒,表达的融合蛋白免疫小鼠后获得了高效价的抗血清,为进一步研制以双歧杆菌为表达系统的新型ETEC亚单位口服疫苗奠定了基础。     

3α-羟类固醇脱氢酶基因的质粒载体构建和表达

目的 实现3α-羟类固醇脱氢酶基因在大肠埃希菌中的高可溶性表达.方法 从土壤中分离睾丸酮丛毛单胞菌,提取其基因组DNA,PCR扩增3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)基因,将它克隆到原核表达载体上进行诱导表达.提取细菌总蛋白进行SDS-PAGE分析并测定酶活性.结果 经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了重组质粒,IPTG诱导表达后,获得融合蛋白,SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子量约为29kDa,与预期理论值一致;酶活性测定结果表明菌体可溶性总蛋白HSD酶比活性为142.81 U/mg,是对照BL21的12.97倍.结论 该研究成功地构建了3α-羟类固醇脱氢酶基因高效原核表达系统,为利用基因工程手段大量制备3α-HSD的工作奠定了基础.     

凋亡素融合蛋白的可溶性表达及活性分析

目的:构建PET-28a-SPA原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中实现其高效可溶性表达,测定对肿瘤细胞的凋亡效果。方法:本实验在获得凋亡蛋白融合基因的基础上,成功地构建了重组表达质粒PET-28a-SPA,将阳性重组质粒转化表达受体菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和Western blot检测,并采用MTT法检测其对肿瘤细胞的增殖抑制。结果:表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,凋亡蛋白融合基因获得高效表达,软件分析表明表达蛋白占菌体蛋白20%左右。上清表达量约为10%。上清蛋白经纯化后,Western blot结果显示,利用凋亡蛋白单克隆抗体可以很好地和所表达的蛋白带特异性结合,并且对A549肺癌细胞及Hela细胞具有一定的凋亡作用。结论:所获凋亡蛋白以高效胞质可溶形式表达,为其研制有效的肿瘤免疫治疗靶向药物提供一定的基础。     

人乳头瘤病毒11型L2NE7E6融合蛋白的原核表达及其诱发的T细胞免疫反应

目的:在原核表达系统中表达人乳头瘤病毒11型(HPV11)L2NE7E6融合蛋白,纯化蛋白后免疫小鼠,检测其诱发的T细胞免疫水平,并筛选HPV11 E6、E7特异的T细胞表位肽。方法:用重叠PCR方法构建HPV11L2NE7E6融合基因并插入原核表达质粒,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达融合蛋白L2NE7E6,用SDS-PAGE和West-ern印迹鉴定融合蛋白的表达。Q柱纯化蛋白后免疫C57BL/6小鼠,分别用覆盖HPV11 E6和E7蛋白序列的肽库,采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测其诱发的E7、E6特异的T细胞免疫反应,并筛选E7、E6特异的T细胞表位肽。结果:在原核表达系统中有效表达了HPV11 L2NE7E6融合蛋白,蛋白纯化后免疫C57BL/6小鼠,分别能检测到针对HPV11 E6、E7肽库刺激产生的特异性T细胞免疫反应。经肽池筛选到1条强的E6 T细胞表位肽E6aa41-55(AEI-YAYAYKNLKVVW);而E7只筛选到2条弱的T细胞表位肽,分别为E7aa53-67(QILTCCCGCDSNVRL)和E7aa73-87(DGDIRQLQDLLLGTL)。结论:HPV11 L2NE7E6融合蛋白能诱发小鼠产生E6、E7特异性细胞免疫反应,可作为尖锐湿疣免疫治疗候选疫苗。