西洋参冠瘿组织悬浮培养及其人参皂苷类成分的分离

对西洋参冠瘿组织悬浮培养生长特征进行了考察,并对其悬浮培养物中的人参皂苷类成分进行了提取、分离和鉴定。研究得到了培养物最大生物量收获时间［18.62 g/L(dry weight)］及其中最高人参皂苷累积时间（620.4 mg/L on the 27thday）。培养基中碳源、磷、氨基氮、硝基氮的利用率分别为91.8%, 100%, 81% 和97%。利用现代分离纯化方法从培养物中分离得到了4种人参皂苷类成分,利用理化及谱学技术分别鉴定为假人参皂苷F11（pseudoginsenoside F₁₁,Ⅰ）, 人参皂苷Rd（ginsenoside Rd,Ⅱ）, 人参皂苷Rb1（ginsenoside Rb1 ,Ⅲ）和人参皂苷Rb3（ginsenoside Rb3,Ⅳ）。     

三裂叶野葛毛状根的诱导及其固体培养和液体培养

发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）ATCC15834感染三裂叶野葛(Pueraria phaseoloides)叶片外植体20 d后产生毛状根,毛状根可直接从叶片外植体叶脉处或从叶脉处产生的愈伤组织上产生。感染35d后,约85%的叶片外植体产生毛状根。毛状根能在无外源生长调节剂的 MS固体和液体培养基上自主生长。PCR扩增结果表明,发根农杆菌Ri质粒的rolB和rolC基因已在三裂叶野葛毛状根基因组中整合并得到表达。与固体培养的毛状根相比,在液体培养基中培养的毛状根不仅生长迅速,也不会形成愈伤组织。在无外源生长调节剂的液体MS培养基中培养15d的三裂叶野葛毛状根的鲜重、干重、可溶性总糖含量及细胞内活性氧(ROS)含量分别为固体培养毛状根的1.59倍、1.18倍、5.25倍和1.16倍。     

美洲商陆毛状根诱导及其离体培养的影响因素

为了探讨利用美洲商陆毛状根生产其药用成分的可能性,研究了美洲商陆毛状根诱导及其离体培养的影响因素。结果表明,美洲商陆叶片外植体被发根农杆菌ATCC 15834感染约18 d后,从其叶片外植体形态学下端叶脉切口处产生毛状根,其中以预培养1 d,农杆菌感染20 min,共培养4 d时的毛状根诱导率最高,达到70%。PCR扩增和硅胶薄层层析结果显示,发根农杆菌Ri质粒的rol C基因以及冠瘿碱合成酶基因已在美洲商陆毛状根基因组中整合和表达。所获得的美洲商陆毛状根系都能在无外源激素的MS固体培养基上快速自主生长;其中以毛状根根系2的生长速度最快、分生侧根能力最强和根表面的根毛密度最高;毛状根根表面呈紫红色或呈白色。在供试的MS、1/2MS、B5和6,7-V液体培养基中,以无外源激素的MS培养基最适合美洲商陆毛状根根系生长。与无外源激素的MS培养基相比,6,7-V培养基更有利于毛状根中商陆皂苷甲的合成与积累。本文所建立的美洲商陆毛状根诱导及其离体培养的适宜条件为今后利用其毛状根株系的规模培养来生产其药用有效成分商陆皂苷甲奠定了实验和技术基础。     

西洋参冠瘿组织培养及其人参皂苷Re和人参皂苷Rg1的产生

考察了培养基组成、培养时间、接种量、pH值、肌醇浓度等对冠瘿组织生长及其人参皂苷含量的影响 ;用HPLC检测了冠瘿组织中人参皂苷Re和人参皂苷Rg1 的含量。高压纸层析电泳证实 ,根癌农杆菌Ti质粒上的T DNA片段已整合进入植物细胞核基因组中。在考察的 6种培养基中 ,White培养基最适合人参皂苷Rg1 的累积(0 0 95 % ) ,MS培养基最适合人参皂苷Re的累积 (0 194 % )。以MS为基本培养基培养 36d、32d时人参皂苷Re和人参皂苷Rg1 累积含量最高 (分别为 0 14 7%和 0 0 6 1% ) ;接种量为 4g、2g (FW flask) ,有利于人参皂苷Re和人参皂苷Rg1的累积 ;培养基pH 5 8时人参皂苷Re含量最高 (0 184 % ) ,培养基pH 5 6时人参皂苷Rg1 累积量最高 (0 0 5 4 % ) ;肌醇浓度为 0 0 5g L时 ,能促进人参皂苷Re合成 (0 182 % ) ,浓度为 0 30g L时 ,有利于人参皂苷Rg1 累积 (0 0 5 5 % )。     

野葛毛状根离体培养与异黄酮生产

用发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）R1601菌株感染野葛（Pueraria lobata(Willd.)Ohwi）叶片外植体后获得的毛状根,经连续4次继代培养,鲜重增加到最初的6.2倍。PH为5.5的1/2SH液体培养基较适合野葛毛状根的生长。与自然根相比,毛状根在无激素的1/2SH液体培养基中离体培养20d后,鲜重增加22.6倍,释放入培养液中的异黄酮量增加10.6倍。毛状根生产异黄酮的量略高于自然根,且根中含量明显高于愈伤组织及茎中异黄酮的含量。培养液体积影响毛状根的离体生长及异黄酮的释放。     

发根农杆菌转化怀地黄再生植株

利用发根农杆菌15834菌株感染怀地黄组培苗子叶、叶柄和茎切段,建立了有效的毛状根培养及其植株再生体系。毛状根可直接从受伤的外植体产生,能在无外源激素的1/2MS固体和液体培养基上自主生长,表现出典型的发根特征。用100μmol/L乙酰丁香酮处理对数生长期的农杆菌菌液感染子叶获得了46.7%的最高转化频率;在附加0.2mg/L KT和3.0mg/L 6/BA的1/2 MS培养基上,毛状根能100%形成愈伤组织,51.49%分化出芽;分化芽在1/2 MS培养基上100%生根,形成具有矮化、节间短和根系发达等特征的转化再生植株且移栽后生长旺盛;1个转化毛状根克隆的梓醇含量为0.557mg/g,是鲜地黄梓醇含量的48.5%,是生地鲜重梓醇含量的18%。rolB基因PCR、Southem blot分析、冠瘿碱纸电泳和RT-PCR扩增检测证明农杆菌Ri质粒上的T-DNA整合到怀地黄基因组中并表达。     

木豆毛状根的诱导及其培养条件的研究

利用发根农杆菌LBA9402对木豆叶片直接进行诱导产生毛状根。本实验研究出诱导木豆毛状根的最佳条件是,以木豆叶片为外植体,于1/2MS固体培养基上预培养2~4 d,菌液浓度OD₆₀₀=0.6~0.8,浸染20 min,共培养3 d,诱导率为60.00%。在分子水平用PCR检测表明,发根农杆菌9402Ri质粒上的T-DNA成功整合进木豆毛状根的基因组中。     

何首乌毛状根培养及其活性成分的产生

利用发根农杆菌LBA940 2诱导药用植物何首乌产生毛状根。PCR扩增和Southern印迹杂交实验证实发根农杆菌中Ri质粒的T-DNA片段已整合进入植物核基因组中。经过基本培养基的筛选和毛状根生长动力学的考察 ,确立了何首乌毛状根在MS培养基中的最佳继代时间为 30d左右。HPLC实验测定结果显示 ,毛状根培养物中大黄酸的含量是原植物的 2 85倍     

诱导人参发根的rolC基因植物表达载体构建及其在人参中的表达

根据Slightom等RiA₄TL-DNA序列分析结果 ,设计了一对引物 ,以R_i 质粒DNA为模板 ,利用PCR方法对rolC基因进行了扩增。利用pGEM-T载体对rolC基因进行了克隆和测序。结果 ,克隆的DNA片段序列与报道的ORF12阅读框内的rolC序列一致。将pGEM-T-rolC用限制性内切酶SacI酶切 ,与经SmaI酶切CIAP去磷酸化的pUC19质粒重组 ,经蓝白斑筛选得到正向重组的pUC19-rolC。再用Xbal-SacI双酶切pUC19-rolC与pBI121 ,将rolC基因定向克隆到具有CaMV35S启动子的pBI121表达质粒上 ,构建成植物表达载体pBI-rolC。用pBI-rolC转化农杆菌LBA4404构建成的LBA4404 (pBI-rolC)工程菌转化人参子叶 ,获得发根的表达。经PCR扩增分子检测 ,证明rolC基因确已整合到人参发根基因组中。经对转化的人参发根中单体皂苷含量测定 ,发现发根中含有所检测的 7种人参单体皂苷 ,总皂苷含量达 18.55mg/g。     

西洋参细胞大量培养的研究

当西洋参细胞培养在Ms培养液中,KN0₃含量提高一倍而去掉NH₄NO₃。时细胞生长速率和皂甙产量分别比在正常培养液中提高65．1％和166．2％。黑节草寡糖素和人参寡糖素均有利于西洋参细胞的生长和皂甙含量的提高,尤其能增加Rg组皂甙的含量。西洋参细胞悬浮培养以生产皂甙收获的最佳时期为培养25天以上,其合成皂甙的高峰在细胞生长的对数期稍后出现。细胞悬浮培养和发酵培养过程中均未见pH值回升的现象。pH值稳定的发酵培养和pH值任其变化的培养相比,其皂甙含量,生长速率和生物量均要高。最后对细胞的培养方式进行了比较。     

新疆雪莲毛状根的诱导及其植株再生体系的建立

利用发根农杆菌R1601、R1000、LBA9402感染新疆雪莲的叶片、叶柄和根段外植体,诱导产生毛状根。毛状根接种量为2.8 g/L(FW)时,20d生长量可达66.7 g/L,黄酮含量达到干重的10.23%。冠瘿碱的检测和rolB基因的PCR分析表明,Ri质粒中的T_DNA片段已经整合到毛状根细胞的基因组中。预培养时间、外植体类型以及发根农杆菌的菌株属性对毛状根诱导有着重要的影响。其中预培养2 d的新疆雪莲根段外植体,经过R1601感染后,毛状根的诱导率可达100%。诱导产生的毛状根在附加生长素的液体培养基中,有少量愈伤组织产生。由毛状根再生的植株与雪莲外植体再生的植株在形态上无明显区别,但前者的黄酮含量仅为后者的53%。     

Selection of high ginsenoside producing ginseng hairy root lines using targeted metabolic analysis

To develop an experimental system for studying ginsenoside biosynthesis, we generated thousands of ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer) hairy roots, genetically transformed roots induced by Agrobacterium rhizogenes, and analyzed the ginsenosides in the samples. 27 putative ginsenosides were detected in ginseng hairy roots. Quantitative and qualitative variations in the seven major ginsenosides were profiled in 993 ginseng hairy root lines using LC/MS and HPLC-UV. Cluster analysis of metabolic profiling data enabled us to select hairy root lines, which varied significantly in ginsenoside production. We selected hairy root lines producing total ginsenoside contents 4-5 times higher than that of a common hairy root population, as well as lines that varied in the ratio of the protopanaxadiol to protopanaxatriol type ginsenoside. Some of the hairy root lines produce only a single ginsenoside in relatively high amounts. These metabolites represent the end product of gene expression, thus metabolic profiling can give a broad view of the biochemical status or biochemical phenotype of a hairy root line that can be directly linked to gene function.     

黄瓜毛状根的诱导及细胞分裂素6-BA对其生长和形态的影响

含农杆碱型Ri质粒pRiA4b的发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)ATCC15834感染黄瓜子叶外植体5d后产生毛状根,毛状根可直接从叶片外植体叶脉处产生。感染10d后,约90%的子叶外植体产生毛状根。毛状根能在无外源生长调节剂的MS固体和液体培养基上自主生长。PCR扩增结果证实,发根农杆菌Ri质粒的rolB和rolC基因已在黄瓜毛状根基因组中整合并得到表达。挑选一无菌黄瓜毛状根系置于含不同浓度6-BA的MS培养基中悬浮培养来探讨细胞分裂素6-BA对黄瓜毛状根生长及其形态变化的影响。结果表明,细胞分裂素6-BA能促进黄瓜毛状根的生长及改变其生长形态。随着培养基中6-BA浓度的升高,黄瓜毛状根变得越来越短而粗,更少分枝。与对照相比,培养基中添加0·1~3·0mg/L6-BA能推迟毛状根最大生长峰的出现,降低其可溶性蛋白含量、SOD和POD酶活性;而黄瓜毛状根的乙烯释放高峰比其最大生长峰和SOD和POD酶活性高峰提前5天,但6-BA处理能降低毛状根的内源乙烯释放量。该结果表明细胞分裂素6-BA可能通过对乙烯生成和释放的调节来影响黄瓜毛状根的生长和形态并延缓毛状根的衰老。     

滇黄芩毛状根的诱导及其黄芩苷含量测定

本文利用发根农杆菌A grobacterizum rhizogenes1.2556感染滇黄芩再生苗的茎段和叶片,建立了毛状根培养及其植株再生体系。毛状根可直接从受伤的茎、叶外植体表面产生,在无外源激素的MS固体和液体培养基上自主生长,表现出典型的发根特征。毛状根茎段的诱导率较叶片高,最高可达到14.44%;经rolB基因PCR分析和甘露碱纸电泳检测,证明Ri质粒T-DNA已整合到滇黄芩基因组中并表达;毛状根在附加6-BA2mg/L和NAA0.2mg/L的MS固体培养基上直接诱导不定芽,并在MS培养基上生根,形成再生植株。获得的毛状根系经MS液体培养基培养30d后通过HPLC都能检测到黄芩苷,其中1个转化系黄芩苷含量为2.59%,是药材黄芩的0.20倍,而从3年单位时间黄芩苷生成量计算,毛状根是药材黄芩的7.18倍。本研究建立的毛状根培养体系,将对滇黄芩转基因技术的完善和利用毛状根生产黄芩苷的生物转化提供了实验基础。     

人参的遗传改良*

遗传改良是人参育种的重要手段之一,而遗传转化和再生体系的建立是开展人参遗传改良工作的前提和基础。人参植株再生可以通过器官发生和体细胞胚发生,间接体细胞胚发生是人参植株再生的主要途径,从不同外植体,不同碳源,体细胞胚优化和无激素再生等方面进行了综述。在人参遗传转化方面,发根农杆菌和根癌农杆菌对人参的遗传转化均已成功,人参皂苷合成途径中的关键酶基因和抗除草剂基因也已陆续导入人参,得到了遗传改良的转化人参。发根培养系统可用于大量生产人参皂苷,讨论了rolC基因对人参发根诱导的作用,发根植株再生能力及生物反应器培养,最后指出了人参基因工程研究中存在的问题。     

烟草毛状根诱导及其茄尼醇含量初探

茄尼醇是合成泛醌类药物的重要中间体.以发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）W.T15834感染烟草叶片诱导产生毛状根,探讨其茄尼醇含量变化.结果显示,获得的毛状根能在无外源生长调节剂的MS固体和液体培养基上自主生长,但在液体培养基中培养的毛状根生长更迅速,也不会形成愈伤组织.甘露碱检测及PCR结果证实,发根农杆菌Ri质粒的rolB基因已在烟草（Nicotiana tabacum）毛状根基因组中整合并得到表达.用改进的HPLC法测定烟草毛状根中的茄尼醇含量,其结果为对照根（种子萌发产生的幼苗根）的1.12倍,但仍比废弃烟叶中茄尼醇含量低43.2%.     

烟草毛状根诱导及其茄尼醇含量初探

茄尼醇是合成泛醌类药物的重要中间体。以发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)W.T15834感染烟草叶片诱导产生毛状根, 探讨其茄尼醇含量变化。结果显示, 获得的毛状根能在无外源生长调节剂的MS固体和液体培养基上自主生长, 但在液体培养基中培养的毛状根生长更迅速, 也不会形成愈伤组织。甘露碱检测及PCR结果证实, 发根农杆菌Ri质粒的rolB基因已在烟草(Nicotiana tabacum)毛状根基因组中整合并得到表达。用改进的HPLC法测定烟草毛状根中的茄尼醇含量, 其结果为对照根(种子萌发产生的幼苗根)的1.12倍, 但仍比废弃烟叶中茄尼醇含量低43.2％。     

Ri质粒转化的青蒿发根培养及青蒿素的生物合成

用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)转化药用植物青蒿(Artemisia annua L．)并建立了发根体外培养系统。Southern杂交、NPT Ⅱ酶的检测证明Ri质粒的T—DNA转移并整合到植物的核基因组上。在发根培养系统中,检测了青蒿的重要次生代谢物一青蒿素的含量,检测了不同理化因子对发根生长及青蒿素含量的影响。结果表明：光照(日光灯,12h光周期,20001x)有利于次生产物青蒿素的积累。培养基的pH值为5．4。蔗糖浓度为3％不仅促进发根的生长,而且促进青蒿素的积累。低浓度萘乙酸(NAA)对发根生长具有促进作用,但抑制青蒿素的合成。赤霉素GA,对发根的生长及次生产物的合成都具有促进作用,其最适浓度为4．8mg／L。