几种因素对电刺激诱导小鼠卵母细胞孤雌活化的影响

为了给小鼠体细胞核移植研究提供最佳的小鼠卵母细胞电激活条件 ,研究了影响电刺激诱导小鼠卵细胞孤雌活化的 4个因素 :脉冲强度、电融合液、操作液预处理及小鼠品系。发现 :(1)小鼠卵母细胞在 0 5～1 2 5kV/cm脉冲强度下 ,获得的活化率差异不显著 (71 4 3%～ 80 39% ,P >0 0 5 ) ,而在 1 5kV/cm的脉冲刺激下 ,活化率显著下降至 4 8 15 % (P <0 0 5 ) ,死亡率显著升高 (2 9 6 3% ,P <0 0 5 ) ;(2 )含有山梨醇的EFS1和含有甘露醇的EFS2对小鼠卵母细胞的活化效果相似 ,但前者较后者更易于操作 ,可以用EFS1取代EFS2运用于小鼠体细胞核移植研究中 ;(3)用核移植操作液预处理小鼠卵母细胞后 ,在 0 75kV/cm的脉冲强度下 ,与对照组无差异 ,而当脉冲强度升至 1 0kV/cm时 ,活化率显著降低 (46 6 7% ,P <0 0 5 ) ,而死亡率显著升高(30 0 0 % ,P <0 0 5 ) ;(4)昆明白小鼠和C5 7BL/ 6小鼠卵母细胞在 0 75～ 1 0kV/cm场强下 ,活化率无差异。     

不同活化方法对小鼠卵母细胞孤雌发育的影响（简报）

In order to study effects of electro-fusion and strontium chloride (SrCl2) activation in nuclear transfer experiment on activation and development of mouse oocytes, concentration and treatment duration of SrCl2, electro-pulse and electro-pulse combining SrCl2 were used to activate mouse oocytes which were obtained after hCG 17h. Activated oocytes were cultured in vitro in CZB medium. The results were as follows: 82.4% activation percentage was obtained when the oocytes were treated with 10mmol/L SrCl2 for 6h, it was significantly (P>0.05) higher than those obtained from that treated with the 5mmol/L or 10mmol/L SrCl2 for 4h. The activation percentage was not significantly different between 5mmol/L and 10mmol/L SrCl2 for 6h, but the percentage of morula and blastocyst in 10mmol/L SrCl2 6h group was significantly (P > 0.05) higher than those in 5mmol/L SrCl2 6h group. In the groups of treatment with electro-pulse, the best activation percentage (70.9%) was obtained when the oocytes were treated with 1.0kv/cm, 320micros, 3 pulses, but M + B percentage (7.9%) was low. In the groups of treatment with electro-pulse combining with SrCl2, the best result was acquired (activation and M + B percentage were 75.0% and 57.3% separately) when the oocytes were treated in 10mmol/L SrCl2 for 6h interval 1h after treated with 1.8kv/cm, 10s, 1pulse. These results show that the treatment with electro-pulse combining SrCl2 is a better way to mouse parthenogenesis.     

应用氯化锶和放线菌酮对小鼠卵母细胞进行孤雌活化的研究

本试验研究了SrCl_2浓度和作用时间,以及卵龄和蛋白合成抑制剂放线菌酮等对昆明种小鼠卵母细胞活化的影响。研究表明,以含1.6mmol/L SrCl_2的无钙M16液对小鼠卵母细胞活化效果最好(87.0％),显著(P<0.05)优于SrCl_2浓度为1.0、5.0、10.0mmol/L的同种液体。SrCl_2作用时间10分钟显著(P<0.05)好于5、20、30或60分钟。注射hCG后18和20小时卵母细胞的活化率(分别为87.0％和84.6％)显著(P<0.01)高于14或16小时的活化率(分别为4.8％和16.5％)。CHX与SrCl_2联合使用产生显著的协同促进卵母细胞活化作用。     

应用氯化锶对小鼠卵母细胞孤雌活化的研究

目的　探讨小鼠卵母细胞孤雌激活的最佳作用条件。方法　将MⅡ期小鼠卵母细胞随机分为 2组 ,第一组 ,将小鼠卵母细胞分别放入 2、4、6、8、10mmol ml不同浓度的氯化锶激活液中 ,作用 6h ,观察激活率及囊胚发育率。第二组 ,将小鼠卵母细胞放入 10mmol ml氯化锶激活液中 ,分别作用 3、6、9h ,观察激活率及囊胚发育率。结果　第一组 ,激活率分别为 86 49%、82 6 1%、88 0 0 %、86 6 7%、81 18%。各组间差异无显著性。体内培养 72h回收囊胚 ,囊胚发育率分别为 0、31 42 %、43 33%、6 2 5 0 %、5 0 0 0 %。 6～ 10mmol mlSrCl2 激活液激活后囊胚发育率高于 0～ 4mmol ml(P <0 0 5 )。第二组 ,激活率分别为 82 86 %、89 6 1%、91.40 %。 72h囊胚发育率分别为 2 6 5 3 %、5 0 0 0 %、5 3 2 2 %。激活 6、9h的囊胚发育率高于激活 3h的囊胚发育率 (P <0 0 1)。结论　结果表明 ,6～ 10mmol ml的SrCl2 为卵母细胞孤雌活化的最佳作用浓度 ,6～ 9h的激活时间为最佳作用时间 ;表明SrCl2 的浓度和作用时间对小鼠卵母细胞的活化有显著的影响。     

不同活化方法对小鼠卵母细胞孤雌发育的影响(简报)

随着动物克隆技术的不断发展,核移植胚胎的活化成为一个很重要的研究领域,活化的效率直接影响到克隆的成功率。小鼠体细胞克隆研究大多采用卵胞质直接注射供体细胞核的方法构建重构胚,再经SrCl_2活化处理进行体外发育。也有经电融合,SrCl_2活化产仔的报道。已有研究表明单独SrCl_2处理或电刺激均能很好地活化小鼠卵母细胞,那么在小鼠核移植过程中采用的电融合条件是否能激活卵母细胞,电脉冲刺激后再经SrCl_2处理是否能     

猪卵母细胞不同孤雌激活方法

研究了离子霉素、电场强度、电脉冲次数和电刺激-化学联合激活对猪卵母细胞孤雌激活的影响,以出现分裂球为激活的标准。结果表明：（1）10μmol／L离子霉素处理5min的激活率62．97％（17／27）与处理10min、15min的激活率62．50％（15／24）、65．21％（15／23）差异不显著（P〉0．05）。（2）以电场强度120V／mm,脉冲次数3次处理猪卵母细胞的激活率66．67％（30／45）与60V／mm、80V／in／n、100V／mm的激活率40．98％（17／42）、44．11％（15／34）、46．19％（18／39）有显著差异（P〈0．05）,但与140V／mm、160V／mm的激活率63．89％（23／36）、64．10％（25／39）无显著差异（P〉0．05）。（3）以电场强度120V／mm,不同电脉冲次数进行激活。以2次电脉冲激活猪卵母细胞的激活率67．40％（31／46）与1次、3次电脉冲的激活率62．80％（27／43）、68．30％（28／41）无显著差异（P〉0．05）。（4）以电场强度120V／mm,2次电脉冲与10μmol／L离子霉素处理5min联合激活猪卵母细胞的激活率84．84％（29／33）与只用电场强度120V／mm,2次电脉冲的激活率67．64％（23／34）差异显著（P〈0．05）。实验结果表明：电场强度120V／mm,2次电脉冲与10μmol／L离子霉素处理5min联合处理激活能有效提高猪卵母细胞孤雌激活的激活率。     

不同因素对大鼠卵母细胞孤雌激活作用影响的研究

本实验比较了SrCl_2,放线菌酮(CHX),电刺激和乙醇等理化因素对SD大鼠卵母细胞激活的作用。结果表明,SrCl_2,CHX和电刺激均能有效激活SD大鼠卵母细胞,其最高激活率分别达到93.24％,91.89％和85.90％。8％乙醇对注射hCG 21小时后的卵母细胞激活率也达70％。SrCl_2在1.6和3.2mmol/L浓度,作用10—30分钟均有较好激活效果。电刺激强度在160V,80μs作用较佳。当SrCl_2与CHX联合作用时,激活率可有明显提高。但电刺激或乙醇与CHX的联合作用不能有效提高激活 率。本研究还比较了卵丘细胞的存在与否对激活的影响,发现卵丘-卵母细胞复合体中的卵母细胞不能被有效激活。刚离体的超排卵母细胞也不能被有效激活,须在体外培养一定时间后才能被激活。     

乙醇及6-DMAP对小鼠卵母细胞孤雌激活的研究

实验研究了乙醇、6-DMAP以及二者联合使用时对注射hCG后18小时采集的小鼠卵母细胞孤雌激活的效果。结果证明:(1)用5％的乙醇分别作用5和10分钟及10％的乙醇分别作用5和10分钟,小鼠卵母细胞的孤雌激活率分别为41.3％、63.7％、57.9％和85.6％。说明在一定范围内,随着乙醇浓度和作用时间的增加,小鼠卵母细胞孤雌激活率有上升的趋势。(2)用2mM 6-DMAP作用2、4和6小时,小鼠卵母细胞的孤雌激活率分别为 12.0％、25.0％和40.0％。说明随着6-DMAP作用时间的增加,小鼠卵母细胞的孤雌激活率有所升高。(3)用5％乙醇作用5分钟,再用含有2mmol/L 6-DMAP的培养液培养6小时,小鼠卵母细胞的孤雌激活率可达65.5％,明显高于单独使用5％乙醇作用5分钟或单独使用2mmol/L 6-DMAP作用6小时卵母细胞的孤雌激活率。(4)用10％的乙醇作用5分钟,再用含有2mmol/L 6-DMAP的培养液培养6小时,小鼠卵母细胞的孤雌激活率达到100％,远远高于单独使用10％乙醇作用5分钟或单独使用2mmol/L 6-DMAP作用6小时卵母细胞的孤雌激活率。(5)在单独使用乙醇刺激时,激活卵母细胞中直接卵裂(2-细胞)的比率随乙醇作用强度的增加而增加,最高达62.5％;但6-DMAP则抑制激活卵母细胞的直接卵裂,增加二原核卵的比例。     

显微受精废弃的人类卵母细胞体外成熟及孤雌激活

以卵胞浆单精注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)后废弃的未成熟人类卵母细胞(生发泡期卵母细胞(the germinal vesicle,GV)和第一次减数分裂中期卵母细胞(the metaphase,MI))为材料,使用卵母细胞体外成熟培养液培养未成熟的卵母细胞,分别在人类绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,hCG)注射后45、60、84 h观察卵母细胞成熟情况.分别使用钙离子载体(calcium ionophore,CI)A23187联合6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)法或精子提取物卵胞质内注射(sperm extracts intracytoplasmic injection,SEII)法两种不同的激活方法对体外成熟MII的卵母细胞进行孤雌激活,评价其体外发育潜能.MI卵子体外成熟率要显著高于GV(75.2%vs 30.6%)(P<0.01).与CI/6-DMAP法相比使用SEII/6-DMAP法在激活率(87.5%vs 70.2%)上要明显高于CI/6-DMAP法(P<0.05),但在卵裂率(65.7%vs 72.5%)和桑囊率(0%vs 5.0%)上SEII/6-DMAP法要低于CI/6-DMAP法.注射hCG 45 h组的卵母细胞激活率(91.3%vs 57.9%)、卵裂率(85.7%vs 57.9%)及桑囊率(9.5%vs 0%)均显著高于注射hCG 60 h组(P<0.01).56.8%(117/206)的ICSI废弃的未成熟卵母细胞可以在体外发育成熟,激活后具有一定的发育潜能,卵龄对卵母细胞的质量和发育能力影响较大.     

6-DMAP对小鼠卵母细胞减数分裂启动及孤雌发育作用

小鼠卵泡卵母细胞体外培养过程中加入2 mmol/L 6-DMAP可抑制卵母细胞自发的染色质浓缩和生发泡破裂(GVBD)。源自超排的MⅡ期卵母细胞则能为6-DMAP所激活。hCG注射后18—19h的卵母细胞置于2 mmol/L6-DMAP的CZB溶液中培养0.5 h、1h、2h、3h,卵母细胞的激活率分别为26.1%、75.2%、75.8%、77.3%、;卵裂率分别为88.2%、73.2%、67.0%、58.4%。与乙醇激活法相比,6-DMAP处理引起了不同的孤雌激活类型。     

钙离子和冈田酸对亚胺环己酮诱导小鼠卵子孤雌激活的影响

哺乳动物卵母细胞在排卵后停滞在第二次减数分裂中期,受精和多种物理或是化学刺激可以克服这一阻滞使卵母细胞活化。蛋白合成抑制剂亚胺环己酮可以诱导小鼠卵母细胞发生孤雌活化,但其机制尚未完全阐明。以前的研究提示亚胺环己酮可能是通过抑制蛋白激酶MOS的合成来发挥孤雌激活的作用的。本实验发现,CHX诱导的卵母细胞孤雌活化是Ca^2 依赖性,其效率可被钙离子载体A23187大大提高,免疫蛋白印迹结果表明,卵母细胞孤雌活化后MAPK发生去磷酸化。蛋白磷酸酶抑制剂冈田酸可以克服CHX＋A23187对小鼠放母细胞活化作用,并且部分阻止MAPK去磷酸化。以上结果表明,抑制MOS的合成并非CHX诱导的孤雌活化过程的惟一原因,并且蛋白磷酸酶抑制剂可以阻断这一激活事件。     

海洋甲藻Pyrocistis elegans电激发光的研究

利用培养的海洋甲藻Ｐｙｒｏｃｉｓｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ（Ｐ．ｅｌｅｇａｎｓ）作为模型,研究外电场对细胞发光强度－时间曲线的影响。实验结果表明,细胞在外电场作用下所产生的发光（电激发光）行为与细胞本身有关,电激发光是一种延迟发光,其松驰过程不遵从指数衰减规律而表现出双曲线的规律。从物理学的角度讨论了细胞电激发光的相干性及外电场对生命系统和非生命系统的作用的区别,前者更重要的是信息作用,从而提示了研究外电场对细胞作用以及细胞与环境和细胞与细胞间通讯的新方法。     

ACTIVATION OF HEXOSE MONOPHOSPHATE PATHWAY IN BRAIN BY ELECTRICAL STIMULATION IN VITRO

Abstract— The incubation of cerebral cortical slices for 15 min in Krebs-Ringer-tris (pH 7.6) solution at 37°C with [1-¹⁴C]glucose or [6-¹⁴C]glucose as substrates yielded a C-1:C-6 ¹⁴CO₂ ratio of 1.21, whereas this ratio increased to 3.01 after the application of electrical stimulation (ES). Tissue levels of 6-phosphoglu-conate (6PG) and glucose 6-phosphate (G6P), intermediary metabolites of hexose monophosphate (HMP) pathway, were 7 and 180 nmol/g tissue following 15 min incubation, and increased by 33 and 45 per cent respectively following the application of ES. Activities of 6-phosphogluconate dehydrogenase (6PGDH, 6-phospho- d -gluconate: NADP⁺ 2-oxidoreductase, EC 1.1.1.44) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH, d -glucose-6-phosphate: NADP⁺ 1-oxidoreductase, EC 1.1.1.49), important enzymes in regulating the activity of HMP pathway, in cerebral cortical slices were 689 and 907 pmol/mg protein/min and were increased by 66 and 25 per cent respectively by the application of ES. Synaptosomal G6PDH and 6PGDH activities were maximally activated by the addition of 40 m m -Na⁺ to the reaction mixture, whereas no activation by Na⁺ was observed in microsomal G6PDH and 6PGDH. Amobarbital inhibited more strongly the Embden–Meyerhof (EM) pathway than the HMP pathway, while imipramine had a stronger inhibitory effect on HMP pathway than on EM pathway in the electrically stimulated cerebral tissues.
The present results indicate that the HMP shunt pathway in the cerebral cortex is activated by the application of ES in vitro , possibly at synaptic regions and may play an important metabolic and functional role in the brain.     

兔卵母细胞体外成熟和体外受精的研究

用贴壁和悬浮生长二种培养系统,分析发情兔血清、滤泡液和激素对体外培养的兔卵母细胞的成熟、原核形成和发育能力的影响,并分析了不同浓度的激素对兔卵母细胞的作用。在贴壁生长的培养系统,滤泡液和激素对卵母细胞有明显的促成熟作用。但用这种卵母细胞体外受精,其原核形成率和发育率都较低。但在体外培养8小时后转移到体内受精,其原核形成和发育率大大提高,三者差别不大。在悬浮培养系统,卵母细胞成熟率、及体外受精后原核形成和发育率都远比贴壁生长的高,尤以原核形成率更甚。兔卵母细胞对激素的耐受力很小,以含FSH(2μg)、LH(1μg)、E_2-17B(1μg)和PRL组合的培波和含低hCG(7IU)的较适宜,高中浓度的FSH、LH和hCG都有促使卵母细胞变性和老化的作用。文中还讨论了二种培养系统不同的机制。     

QUANTITATIVE IN VITRO STUDIES ON STIMULATION OF MURINE HAEMOPOIETIC CELLS BY COLONY STIMULATING FACTOR

A new standardization method for Colony Stimulating Factor (CSF) is described and criteria are introduced which enables stimulating activity to be assessed independent of absolute colony numbers. With this method CSF preparations from different sources are compared and evidence is presented that suggests an identical mechanism of action for these substances. Data are presented on the increase in colony numbers that is induced by the addition of erythrocyte lysates to the cultures. The relationship between colony forming cells that are stimulated by CSF alone and cells stimulated by the combined action of CSF and erythrocyte lysate is discussed.