灰树花多糖药理研究进展

真菌多糖的药理作用已得到广泛的研究与关注。作为一种独特的生物反应调节剂,灰树花多糖具有极大的开发利用前景。本文综述了国内外灰树花多糖药理研究的进展情况。     

灰树花多糖对果蝇繁殖力及抗氧化作用的影响

实验采用超声辅助水提法提取灰树花多糖,以黑腹果蝇为实验对象,探究含0.2%,0.8%和1.6%浓度的灰树花多糖的培养基对果蝇繁殖力、体内脂褐素(LF)和过氧化氢酶(CAT)活性的影响。与对照组相比,各浓度组的灰树花多糖均能明显增强果蝇繁殖力,且对果蝇后代的雌雄比例产生一定影响;同时使果蝇体内LF含量明显下降,CAT活性显著升高。各浓度组间差异显著,尤以1.6%效果最佳。结果表明,灰树花多糖具有促进果蝇繁殖力和抗氧化的良好功效。     

灰树花胞外多糖对四氯化碳致小鼠肝损伤的保护作用

四氯化碳可导致小鼠急性肝损伤,采用灰树花胞外多糖(GFP)防治后,对其血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT),天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和过氧化氢酶活力(CAT)以及肝组织匀浆中的丙二醛(MDA)和乳酸脱氢酶(LDH)进行测定,与模型组相比较,灰树花胞外多糖治疗组ALT、AST、MDA、LDH活力明显降低,而CAT活力明显升高。通过组织切片染色可以直观的看出灰树花胞外多糖能显著减轻肝组织病理变化程度。结果显示GFP对CCL4致小鼠急性肝损伤具有保护作用。     

灰树花多糖的提取及抗氧化活性

采用单因素和正交试验法对热水浸提、超声波辅助和微波辅助提取灰树花多糖的工艺进行研究,分别获得了3种方法的最佳条件,并发现微波辅助法最佳,其最优条件为:微波功率800 W、微波时间3 min,浸提2h,多糖得率为13.05％,比热水浸提法提高了51.22％.利用提取的灰树花多糖进行抗氧化性研究,发现灰树花多糖对O2-·和·OH都具有一定的清除作用,且多糖浓度与其对O2-·的清除作用存在量效关系,但不如·OH明显.     

离子束注入技术筛选灰树花多糖产生菌的研究

本文用20×1013ion/cm2～100×1013ion/cm2剂量的N+离子注入灰树花菌,设5个处理,0处理为对照,观测菌丝长势、菌丝长速、纤维素酶活、菌丝生长量、多糖含量探讨离子注入的效应与影响。结果表明,适宜剂量的离子注入促进生长、增加纤维素酶活和产物积累,灰色关联分析得到离子注入的最适剂量为40×1013ion/cm2～60×1013ion/cm2;并用纸层析和GC法对离子注入处理和对照菌的产物进行比较鉴定,结果显示多糖性质与结构一致。     

微波辅助提取灰树花多糖工艺研究

采用提取时间、微波功率、液料比的单因素试验和正交试验法优化微波辅助提取灰树花多糖条件.结果表明,以净多糖得率为指标,影响微波辅助提取灰树花多糖的主次因素为:提取时间＞微波功率＞液料比,并且提取时间和微波功率的影响达到了极显著水平.灰树花多糖最佳提取工艺条件为:提取时间为10 min,微波功率为80%(全功率为800 W),液料比为25∶1.创立了一种用苯酚-硫酸法测定多糖时排除蛋白质干扰的方法.     

灰树花多糖对乳腺癌细胞MCF-7的凋亡作用

采用MTT法测定不同给药浓度的灰树花多糖(PGF) (1、10、20、50、100和200 μg/mL)在24、48和72 h对乳腺癌细胞(MCF-7)增殖的抑制率,并采用Hoechst染色与流式细胞技术观察20、50和100 μg/mL PGF给药24 h后MCF-7的凋亡情况,同时采用Western blotting对20、50、100 μg/mL PGF给药24 h后MCF-7细胞中Bax、Bcl-2、Pro-Caspase-3以及Cleaved Caspase-3的蛋白表达水平进行检测。研究发现PGF给药24、48和72 h后对MCF-7的增殖均有显著的抑制作用。随着PGF给药浓度增加,MCF-7细胞核裂解增多,细胞凋亡数量增多。PGF 20、50和100 μg/mL给药对MCF-7细胞Bax、Bcl-2、Pro-Caspase-3以及Cleaved Caspase-3的蛋白表达水平可见显著性差异。     

发酵法生产灰树花菌丝体的研究

对灰树花发酵条件进行了探索,其中3t罐的试验结果为：干菌体收率25．0g／L,发酵周期116h,粗多糖含量25％。经动物试验表明,灰树花菌丝体具有降血脂、正向调节免疫的作用。     

中药提取物对灰树花深层发酵产胞外多糖的影响

为筛选促进灰树花Grifola frondosa深层发酵的中药提取物,以期提高灰树花发酵产胞外多糖的产量,在灰树花液体深层发酵体系中添加12种中药(白花蛇舌草、金银花、淡竹叶、柚子皮、银杏叶、何首乌、薏苡仁、菊花、甘草、山药、枸杞、天麻)水提物和醇提物,以生物量和胞外多糖为指标,从中筛选出2种最适中药,并通过在发酵体系中单一添加和组合添加2种最适中药醇提物,确定2种中药的最适浓度和最适组合浓度。试验结果表明:对灰树花生物量与胞外多糖产量影响最大的中药是薏苡仁和天麻;添加薏苡仁醇提物质量浓度8 g/L时,灰树花生物量达到最大值,为14.43 g/L;发酵产胞外多糖的最佳条件为组合中药醇提物,即薏苡仁和天麻醇提物质量浓度均为6 g/L时,胞外多糖产量达3.61 g/L。试验结果为提高灰树花液体深层发酵的生物量和代谢产物合成量提供了新思路和新方法。     

灰树花深层发酵培养基的研究

灰树花具有较宽广的碳源谱和氮源谱,其最佳碳源为马铃薯汁加葡萄糖,最佳氮源为麸皮。在有生长促进剂一板栗壳煮汁作用下,菌丝的增产率达１４０％。培养基的氮源种类和生长促进剂对菌丝生长具显著的影响,两者交互作用明显。培养基中碳源浓度过高不利于菌丝的生长。灰树花深层发酵的较佳培养基为ＱＦ培养基：葡萄糖６０９,ＫＨ_２ＰＯ_４ ｌｇ,ＭｇＳＯ_４ ０．５ｇ,ＣａＣｌ_２ ０．１ｇ板栗壳煮汁 １５０ｇ,水１Ｌ。     

灰树花深层发酵工艺条件的研究

灰树花摇瓶发酵较佳条件 :QF培养基 ,2 5℃ ,pH4 5,装量 60mL/50 0mL三角瓶 ,转速 1 0 0r/min。在种子培养基中加 0 4%的CMC ,可增加种子液菌丝的生长点 ,从而提高菌丝量。在 1 0L气升式发酵罐上放大试验 ,菌丝量对初糖的生物转化率在 2 4 %以上 ,对耗糖的转化率达 435%。菌丝体中多糖含量达 1 0 2 % ,发酵液中多糖含量为 1 38%。     

灰树花gpd-Gf启动子的功能分析

利用从灰树花菌丝体中克隆的gpd-Gf（615bp）启动子片段串联于报告基因gfp上游,构建启动子功能活性检测表达质粒pGg-gfp。采用PEG介导法把表达质粒pGg-gfp与辅助质粒pCc1001（含有trp1基因）共转化进色氨酸营养缺陷型的灰盖鬼伞粉孢子的原生质体中。经过选择培养基筛选、假定转化子的分子鉴定以及GFP荧光检测, 结果表明：灰树花gpd-Gf启动子在灰盖鬼伞菌丝中具有较强驱动gfp基因表达的活性,在荧光显微镜和共聚焦显微镜下可以观察到转化子菌丝发出的强烈荧光。     

Degradation of polychlorinated biphenyls by a ‘Maitake’ mushroom, Grifola frondosa

The edible mushroom Maitake, Grifola frondosa M51, degraded 40 components in the 41 major peaks of polychlorinated biphenyls (PCBs), which includes di- to hexa-chlorobiphenyls, within 60 days. The organism accumulated dichloro-methoxy-phenol during the transformation of the PCB mixture.     

灰树花海藻糖合成酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

海藻糖主要作用是作为生物体的结构组分、以及保护生物膜和保护蛋白质。在灰树花中 ,海藻糖在干重中所占比例最高可达到 1 5 %～ 1 7% ,说明灰树花合成海藻糖的能力很强。将灰树花海藻糖合成酶基因克隆 ,并在大肠杆菌表达系统里表达。表达量为 1 90mg L。通过活性测定 ,证明在大肠杆菌中表达的海藻糖合成酶具有酶活性 ,结合基因工程和酶工程方法 ,为合成海藻糖的研究提供了新的方向     

灰树花生长发育过程中的几种胞外酶活性变化

胞外CMC酶、FP酶、HC酶活性高峰出现于子实体的成熟期;胞外淀粉酶活性在菌丝生长的前期阶段较高,以后逐渐下降;胞外漆酶活性在菌丝生长阶段一直较高,原基形成后逐渐下降;胞外过氧化物酶活性在菌丝生长阶段较高,子实体生长发育阶段明显下降,子实体成熟后消失.     

灰树花总DNA的制备及基因组文库的构建A

灰树花是一种珍贵的药用真菌,因为多糖含量较高,较难获得高质量的总DNA,本文提出了一种制备高质量灰树花总DNA及构建灰树花基因组文库的方法。该方法制备的灰树花总DNA,经Sau3AI酶切后,用于构建基因组文库,可得到2×105个转化子/50mg,平均插入片段为14kb。本研究为下一步克隆灰树花中的基因以及进行其他分子生物学研究奠定了基础。Abstract： Grifola frondosa, is a valuable medicinal fungus. High quality total genomic DNA is difficult to prepare due to its high polysaccharide content. A method for the preparation of Grifola frondosa total genomic DNA and construction of Grifola frondosa, genomic library is described. Genomic DNA prepared by this method is digested by Sau3A I restriction enzyme. Constructed genomic library give a titer of 2×105 transformants/50mg , with a average insert size of 14kb. This has paved way for the cloning of other Grifola frondosa genes and molecular biology studies.