构建重组枯草芽孢杆菌催化制备D-对羟基苯甘氨酸

目的: 在Bacillus subtilis中表达异源D-海因酶基因(hyd)和D-氨甲酰水解酶基因(adc),构建重组细胞作为催化剂,用于生产D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)。方法: 构建hyd表达质粒,考察培养基中二价金属离子对D-海因酶活性的影响。过表达acoR基因,考察AcoR蛋白胞内水平与P_acoA-hyd基因拷贝数的关系。筛选表达adc基因的启动子,构建hyd和adc基因共表达质粒,考察双酶活性菌株的催化特性。结果: 成功构建了海因酶表达质粒pHPS和pUBS,培养基中添加0.8mmol/L的MnCl₂·4H₂O,使168N/pUBS菌株的D-海因酶活性达到956U/gDCW。整合表达P_cdd-acoR基因,使LSL02/pUBS菌株的D-海因酶活性达到1 470U/gDCW。单拷贝P_AE-adc基因的表达水平相对最高。双酶共表达质粒pUBSC被成功构建,菌株LSL02/pUBSC的最适催化温度为40℃45℃,催化活性能够持续12h,当底物起始浓度为20g/L时,反应12h生成的D-HPG达到14.32g/L,转化率达到95%,收率超过80%。结论: 构建具有D-海因酶和D-氨甲酰水解酶双酶活性的重组Bacillus subtilis作为全细胞催化剂,用于海因酶法生产D-HPG,具有技术上的可行性和优势。     

海因酶与氨甲酰水解酶产生菌的鉴定及分布

利用Biolog微生物鉴定系统和16S rDNA序列分析相结合的方法对自行筛选的24株海因酶和氨甲酰水解酶产生菌进行了鉴定。海因酶与氨甲酰水解酶产生菌主要分布在Bacillus,Geobacillus,Brevibacillus,Aneurinibacillus,Microbacterium,Pseudomonas,Kurthia和Empedobacter等菌属,特别的是,Kurthia和Empedobacter是新的海因酶和氨甲酰水解酶产生菌属,说明海因酶和氨甲酰水解酶产生菌在细菌中分布较广泛。进一步分析比较发现,D-海因酶产生菌主要分布于Pseudomonas,Agrobacterium等菌属中,而大部分L-海因酶产生菌分布于Bacillus,Geobacillus,Microbacterium等菌属中,说明D-海因酶产生菌与L-海因酶产生菌分布特点具有一定的种属倾向性。这些工作不仅提供了多种海因酶和N-氨甲酰水解酶的生物材料,而且对双酶的结构与功能及分子进化研究等具有重要意义。     

海因酶法制备D-对羟基苯甘氨酸的研究进展

D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)主要用于合成β-内酰胺类半合成抗生素,是国内最紧缺的医药中间体之一。微生物酶法是目前获得光学纯D-HPG的重要途径,微生物中起催化作用的主要是D-海因酶和N-氨甲酰水解酶。文章综述了产酶微生物的来源,酶的理化性质,以及培养条件的优化、基因工程、酶的固定化技术生产D-HPG的研究进展。     

重组共表达大肠杆菌细胞从D-葡萄糖一锅法生产D-甘露糖

【背景】D-甘露糖的酶促转化方法已受到相当大的关注。【目的】研究D-葡萄糖异构酶(D-glucoseisomerase,D-GIase)和D-来苏糖异构酶(D-lyxoseisomerase,D-LIase)共表达于大肠杆菌细胞生产D-甘露糖的工艺条件。【方法】将D-GIase和D-LIase基因片段合成后酶切连接到载体p CDFDuet-1上,构建p CDFDuet-Acce-DGI/Peba-DLI重组质粒并导入到大肠杆菌BL21(DE3)中共表达,通过摇瓶培养得到产D-GIase和D-LIase的菌体,测定该共表达细胞体系的反应条件。【结果】添加1 mmol/L Co~(2+),共表达体系酶的最适温度和p H分别为70°C和6.0。以浓度分别为100、300、500 g/L的D-葡萄糖为底物生产D-甘露糖,平衡后D-甘露糖质量浓度分别为13.8、38.1、62.6 g/L,相应的转化率分别为13.8%、12.7%、12.5%,D-葡萄糖、D-果糖和D-甘露糖的平衡比约为50:37.5:12.5。【结论】D-GIase和D-LIase在大肠杆菌细胞中组成的共表达体系通过一锅法可利用D-葡萄糖为底物生产D-甘露糖。     

链霉菌来源D-甘露糖异构酶的性质及其在制备D-甘露糖中的应用

【背景】D-甘露糖具有多种功能活性,在食品、医药、饲料等行业应用广泛。D-甘露糖异构酶可以催化D-果糖与D-甘露糖之间的相互转化,在D-甘露糖的酶法制备中具有应用潜力。【目的】克隆一个链霉菌(Streptomycessp.)来源的D-甘露糖异构酶基因(ssMIaseA)并在大肠杆菌中表达,研究其酶学性质,并用于制备D-甘露糖。【方法】从链霉菌(Streptomycessp.)中发掘一个D-甘露糖异构酶基因(ssMIaseA),构建重组表达质粒pET-28a-ssMIaseA并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经Ni-NTA亲和层析纯化后测定酶学性质,利用高效液相色谱对SsMIaseA制备D-甘露糖进行研究。【结果】SsMIaseA与嗜热裂孢菌(Thermobifda fusca)来源的D-甘露糖异构酶ManI相似性最高,为60.2%。该酶比酶活为525 U/mg,分子量约为45 kD,最适pH和温度分别为7.5和45°C,在pH 6.5-10.0范围内和45°C以下保持稳定。该酶对甘露糖具有最高催化活性,其次是果糖、塔罗糖和塔格糖。利用SsMIaseA转化600 g/L D-果糖,反应8 h达到平衡,生成185 g/L D-甘露糖,转化率为31%。【结论】SsMIaseA作为新型D-甘露糖异构酶为D-甘露糖的酶法制备奠定了基础。     

假单胞菌海因酶基因在大肠杆菌中的高效表达(英文)

为实现利用生物酶转化法进行D 对羟基苯甘氨酸的工业化生产 ,构建了 3株海因酶基因工程菌 .利用PCR技术从恶臭假单胞菌 (Pseudomonasputida)CPU 980 1染色体DNA中扩增得到长约1.8kb的含编码区和自身启动子的海因酶全基因 .通过将海因酶全基因插入pMD18 T质粒、海因酶基因的编码区与pET 17 b质粒重组、海因酶基因编码区和T7强启动子一起插入pMD18 T质粒分别得到重组质粒pMD dht、pET dht和pMD T7 dht.将上述重组质粒分别转化大肠杆菌 (Escherichiacoli) ,通过地高辛标记菌落原位杂交和海因酶活力测定两种方法 ,筛选出具有海因酶活力的阳性转化子 .结果表明 ,大肠杆菌的RNA聚合酶能够识别和结合来自恶臭假单胞菌海因酶基因的自身启动子 ,该启动子在大肠杆菌中能够工作 .基因工程菌E .coliBL2 1 pMD dht、E .coliBL2 1 pET dht和E .coliBL2 1 pMD T7 dht的海因酶活力分别为 170 0U L、190 0U L和 2 5 0 0U L ,比野生菌P .putidaCPU 980 1的海因酶活力分别提高了 8倍、9倍和 12倍 .薄层扫描结果显示 ,这些工程菌的海因酶表达量分别约占菌体总可溶性蛋白质的 2 0 %、31%和 5 7%.SDS PAGE显示 ,海因酶的单体分子量约为 5 0kD .经工程菌E .coliBL2 1 pMD T7 dht催化 ,底物对羟基苯海因的转化率在 13h内可达到 9     

N-氨甲酰基氨基酸水解酶在毕赤酵母中的表达

N-氨甲酰氨基酸水解酶是乙内酰脲酶系的组成部分,催化N-氨甲酰氨基酸水解为相应氨基酸。节杆菌BT801的N-氨甲酰氨基酸水解酶是该菌乙内酰脲酶系中惟一具立体专一性的酶,也是整个反应体系的限速酶。通过PCR从携带乙内酰脲酶系完整操纵子的亚克隆质粒pUC18-169上扩增得到N-氨甲酰氨基酸水解酶基因(hyuC)片段,连接到载体pPIC3.5K上,经BglⅡ酶切线性化,通过PEG法转化导入毕赤酵母GS115感受态细胞,利用G418抗性筛选得到插入多拷贝目的基因的转化子。酶活性分析表明所得转化子具     

葡萄糖醛酸木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中的表达及发酵条件优化

为了研究葡萄糖醛酸木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中异源表达,笔者从枯草芽孢杆菌中克隆得到带有自身信号肽的葡萄糖醛酸木聚糖酶基因,将其构建到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒中,转化入枯草芽孢杆菌WB800,得到重组菌。通过发酵条件以及培养基成分优化,重组菌中葡萄糖醛酸木聚糖酶酶活达到76.0 U/mL,约为优化前产酶量的5.4倍。葡萄糖醛酸木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中实现高效异源表达,为其进一步的实际应用奠定了基础。     

利用乳酸乳球菌AcmA表面展示b-1, 3-1, 4-葡聚糖酶

采用PCR扩增乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MB191菌株的全长肽聚糖水解酶基因acmA, 通过C-末端融合构建了与绿色荧光基因gfp的融合基因acmA-gfp, 再连接于表达载体pMG36k上后得到可组成型表达AcmA-GFP融合蛋白的重组质粒pMB137, 然后将该质粒电转化导入到乳酸乳球菌AS1.2829中获得重组菌MB137。经SDS-PAGE检测, 重组菌MB137可表达预期的分子量约74 kD的蛋白质。Western blotting、细胞分级分离组分的荧光活性测定和特异GFP二抗标记的流式细胞仪检测证实GFP被成功锚定在重组菌细胞表面, 被锚定蛋白约占总表达融合蛋白的35%。进一步通过从枯草芽胞杆菌BF7658基因组中扩增去信号肽序列的b-1, 3-1, 4葡聚糖酶基因gls, 来取代pMB137中的gfp, 得到携带融合基因acmA-gls的重组质粒pMB138, 经导入到乳酸乳球菌AS1.2829后得到重组菌MB138, 其全细胞b-1, 3-1, 4-葡聚糖水解酶的活性约为12 U/mL菌液, 明显高于对照菌株。     

亮氨酸脱氢酶与葡萄糖脱氢酶高效共表达制备L-叔亮氨酸北大核心CSCD

【目的】通过不同双基因共表达策略对亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶基因在大肠杆菌中表达影响的研究,获得具有高辅酶再生效率的双酶共表达重组生物催化剂,实现L-叔亮氨酸"一锅法"高效不对称合成。【方法】以来自于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的亮氨酸脱氢酶(LDH)和来自芽孢菌属(Bacillus sp.)的葡萄糖脱氢酶(GDH)为模板,考察单质粒共表达,双质粒共表达和融合表达等3种共表达策略对重组细胞中亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶活的影响,比较不同酶活比例和不同催化剂形式对三甲基丙酮酸不对称还原制备L-叔亮氨酸效率的影响。【结果】研究发现不同共表达策略对亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的影响存在明显差异。亮氨酸脱氢酶在不同策略下均能够正常表达,而葡萄糖脱氢酶在融合表达时没有活力,当C端含有组氨酸标签时,表达蛋白活性低。通过表达优化,获得3株亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶高效表达且具有不同酶活比例的重组菌。比较粗酶液和全细胞形式下的催化效率,发现酶活比例及催化剂形式对不对称还原反应效率具有重要影响。确定单质粒串联表达C端不含His标签重组菌E.coli BL21/p ET28a-L-SD-AS-G为最佳催化剂,以粗酶液进行转化时,完全转化0.5 mol/L底物所需菌体量为15 g/L,辅酶量为0.1 mmol/L。【结论】采用单质粒共表达策略,成功构建出1株具有较高亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶活性的重组菌,实现高效催化TMP合成L-Tle。     

High-level production of TaqI restriction endonuclease by three different expression systems in Escherichia coli cells using the T7 phage promoter

Three different expression systems were constructed for the high-level production of TaqI restriction endonuclease in recombinant Escherichia colicells. In system [R], the TaqI endonuclease gene was cloned and expressed under the control of the strong T7 RNA polymerase promoter. To protect cellular DNA, methylase protection was provided by constitutive co-expression of TaqI methylase activity either by cloning the TaqI methylase gene on a second plasmid (system [R,M]) or by constructing a recombinant plasmid harboring both the endonuclease and methylase genes (system [R+M]). In batch shake flasks containing complex media, co-expression of the methylase gene in systems [R,M] and [R+M] resulted in a 2- and 3-fold increase in volumetric productivity over system [R], yielding activities of 250x10(6) U l(-1) and 350x10(6) U l(-1), which were 28 and 39 times higher than the data in the literature, respectively. Under controlled bioreactor conditions in chemically defined medium, co-expression of methylase activity greatly improved the yield and specific TaqI endonuclease productivity of the recombinant cells, and reduced acetic acid excretion levels. System [R,M] is preferable for high expression levels at longer operation periods, while system [R+M] is well-suited for high expression levels in short-term bioreactor operation.     

乙酰乳酸合成酶基因的克隆与高效表达

【目的】乙酰乳酸合成酶(ALS)是异丁醇生物合成中的关键酶,实现ALS的高效表达对调控异丁醇代谢途径有重要意义。【方法】根据GenBank中ALS的基因序列(alsS)设计引物,以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板通过PCR扩增技术得到目标酶基因,目的片段全长为1 713 bp。将alsS连接到pET-30a(+)上,得到重组质粒pET-30a(+)-alsS,并在Escherichia coli BL2l(DE3)中实现表达。【结果】对表达条件进行了优化,获得最佳表达条件为:诱导温度30°C,诱导起始菌体OD600为0.6 0.8,诱导剂IPTG浓度为1 mmol/L,诱导时间为6 h。表达的乙酰乳酸合成酶大部分以可溶性形式存在于菌体内,优化后酶活可达到24.4 U/mL,比优化前提高了7.13倍。经HisTrapTMFF亲和层析后获得电泳纯的ALS,比活为95.2 U/mg。【结论】ALS的有效表达为在大肠杆菌体内构建异丁醇代谢途径打下了基础。     

用GAP启动子在Pichia pastoris GS115中组成型表达鼠灰链霉菌腺苷酸脱氨酶

【目的】构建产AMP脱氨酶的重组毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)菌株,并初步优化其发酵条件。【方法】以鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)基因组为模板PCR扩增获得腺苷酸脱氨酶基因AMPD,以pGAP9K为载体构建重组表达质粒pGAP9K-AMPD并通过电转化法转入Pichia pastoris GS115,筛选转化子对其酶活进行测定,并初步优化其发酵条件。【结果】构建了毕赤酵母重组菌,通过分光光度法测定,显示重组菌有明显的酶活;初步优化发酵条件为:该重组菌最适发酵培养基为:甘油2%,蛋白胨2%,酵母膏1%,KH2PO40.5%,MgSO4·7H2O0.05%,pH 6.0;发酵条件为:接种龄24 h,转接量3%,30°C﹑200 r/min培养96 h,取发酵上清液测定酶活,重组菌腺苷酸脱氨酶酶活达到2 230±60 U/mL。【结论】构建了一株产AMP脱氨酶活性较高的重组毕赤酵母菌株,并通过优化发酵条件使其酶活达到2 230±60 U/mL。为AMP脱氨酶工业化生产奠定了一定的基础。     

重组枯草芽胞杆菌不对称还原产d-伪麻黄碱

为了实现羰基还原酶基因mldh在枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis中的表达并通过细胞内的葡萄糖脱氢酶完成辅酶的再生,以枯草芽胞杆菌rpsD基因的启动子PrpsD和终止子TrpsD为表达元件,将羰基还原酶基因mldh连接至构建好的质粒(pHY300plk-PrpsD-TrpsD上,得到质粒pHY300plk-PrpsD-mldh-TrpsD;进一步将重组质粒转化入B. subtilis Wb600中获得重组菌B. subtilis Wb600 (pHY300plk-PrpsD-mldh-Trps     

枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因的克隆及其在大肠杆菌中融合表达

以自行分离筛选出的天然枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）C-36的染色体DNA为模板,PCR扩增得到含有内切葡聚糖酶基因的DNA片段,将其克隆到pMD-18T载体中,序列分析表明,克隆得到的DNA片段全长1602bp,编码一个含有499个氨基酸的多肽。与其他芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因序列比对,其核苷酸同源率为90％～93％,其编码的氨基酸序列的同源性在90％～98％,已将此基因注册GenBank（DQ782954）。将含内切葡聚糖酶基因的重组克隆质粒进行亚克隆,用Kpn I和EcoR I双酶切后,与相同酶切的表达载体pET-32a相连接,并导入大肠杆菌BL21中表达。蛋白质电泳实验结果表明在6．47×10^4处有表达蛋白带。经测定表达蛋白比酶活力达99．02U／mL,为出发菌C-36（63．78U／mL）的1．55倍。     

费希尔曲霉脂肪酶在毕赤酵母中的优化表达及高密度发酵

【背景】脂肪酶广泛应用于纺织、食品、药品、皮革等工业领域,其在微生物中的异源表达研究进一步促进了脂肪酶产品的生产和应用。【目的】实现来源于费希尔曲霉的脂肪酶在毕赤酵母中的高效异源表达,探究其合适的表达及发酵条件,提高产量,降低成本。【方法】对费希尔曲霉的脂肪酶编码基因进行密码子优化后,应用pPIC9k质粒整合到毕赤酵母GS115基因组上,构建高产脂肪酶Lip605的毕赤酵母工程菌;并通过响应面发酵条件优化、筛选最适伴侣蛋白和高密度发酵相结合的方法,综合提高脂肪酶表达量。【结果】确定高产脂肪酶毕赤酵母工程菌的最优摇瓶发酵产酶条件为:甲醇3.103%(体积比),生物素0.4 mg/L,酵母粉11.5 g/L,酵母基础氮源培养基(yeast nitrogen base,YNB) 13.4 g/L,初始pH 6.4,装液量50 mL/250 mL,转速220 r/min,温度24°C,培养时间40 h。优化后的胞外脂肪酶酶活达到72.34 U/mL,较优化前提高了5.8倍;进一步选择12个伴侣蛋白分别与脂肪酶Lip605进行共表达,其中共表达伴侣蛋白Rpl10(pPICZA-RPL10)效果最佳,可使Lip605表达量进一步提高46.8%;在此基础上,经过10 L发酵罐分批补料的高密度发酵,工程菌株发酵142 h,胞外脂肪酶酶活最高达到680 U/mL,蛋白浓度为15.89 g/L。【结论】应用复合策略有效提高了脂肪酶Lip605在毕赤酵母中的发酵产量,为其进一步工业化生产奠定了良好的基础。     

腺苷酸脱氨酶在乳酸克鲁维酵母中构建表达

【目的】实现鼠灰链霉菌来源经密码子优化后的腺苷酸脱氨酶基因在乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis GG799)中组成型表达。【方法】以鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)来源的腺苷酸脱氨酶(AMP)基因经密码子优化后作为模板,设计特异性引物,PCR扩增AMP脱氨酶基因opt-AMPD,以p KLAC1为载体构建重组表达质粒p KLAC1-opt-AMPD,经Sac II线性化后电转化法转入K.lactis GG799,筛选得到重组菌株,测定酶活,经His TrapTM HP纯化后得到AMP脱氨酶,并优化重组菌的发酵培养基。【结果】对AMP脱氨酶基因进行了密码子优化后,构建了重组K.lactis GG799/p KLAC1-opt-AMPD,实现组成型表达,密码子优化后AMP脱氨酶酶活提高到586±50 U/m L。SDS-PAGE结果显示,纯化后的AMP脱氨酶为单一条带,蛋白大小约为60 k D。优化的发酵培养基为(g/L):葡萄糖40、蛋白胨20、酵母粉15、Na Cl 8、KCl 10、Mg SO4 2,30°C、200 r/min发酵120 h,酶活达到2 100±60 U/m L。【结论】实现了密码子优化后的腺苷酸脱氨酶基因在乳酸克鲁维酵母GG799内的组成型表达,为实现腺苷酸脱氨酶的重组高效表达和发酵生产进行了有益探索。