小麦TaLCD基因的克隆及其对渗透胁迫的调节作用

半胱氨酸脱巯基酶(CDes)可催化降解半胱氨酸(Cys)生成硫化氢(H₂S)。通过克隆小麦(Triticum aestivum)中的L-半胱氨酸脱巯基酶基因TaLCD, 并将其在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中过表达, 探讨TaLCD对渗透胁迫条件下种子萌发和根系生长的影响, 并分析其对干旱胁迫的调节作用。结果显示, 盐胁迫条件下, TaLCD过表达植株种子萌发率显著高于野生型; 甘露醇处理条件下, TaLCD过表达植株的根长也显著高于野生型, 且TaLCD过表达显著提高植株抗旱性。此外, TaLCD过表达植株对ABA更加敏感, ABA处理下TaLCD过表达植株的种子萌发率及根长均显著低于野生型。干旱胁迫下, TaLCD过表达植株胁迫响应基因(COR47、RD29A、RAB18和RD22)及ABA信号途径相关基因(NCED3、HAB1、HAB2、ABI1、ABI2和ABF2)的表达水平均显著高于野生型。因此推测, TaLCD增强植株抗旱和抗盐能力可能依赖于ABA信号途径。     

AtERF49在拟南芥应答盐碱胁迫中的作用

盐碱胁迫是造成作物减产的主要逆境因素之一。植物AP2/ERF（APELATA2/ethylene response factors）转录因子在植物生长发育及其响应非生物逆境胁迫过程中发挥重要作用。探究AtERF49在拟南芥中对盐碱胁迫的应答,为深入解析AtERF49参与植物对盐碱胁迫的分子机理奠定基础。选取拟南芥野生型Col-0、过表达AtERF49转基因拟南芥和CRISPR/Cas9突变体erf49为试验材料,用150 mmol/L混合盐碱（摩尔比NaHCO₃∶Na₂CO₃=9∶1）溶液进行处理,使用荧光定量PCR技术对该基因的基本特性、盐碱胁迫及光合响应基因表达模式等进行分析。结果表明,盐碱胁迫处理后,突变体erf49叶片萎蔫并发生白化,而过表达AtERF49植株叶片稍有变黄。此外,在盐碱胁迫条件下,过量表达AtERF49上调盐碱胁迫响应基因（RD29A和RAB18）以及光合响应基因rbcL的表达。拟南芥叶片叶绿素荧光参数测定结果表明,过表达AtERF49植株的光系统Ⅱ实际量子产能Y（Ⅱ）、光化学淬灭系数（qP）显著高于Col-0,光损伤程度（NO）和非光化学淬灭系数（qN）显著低于Col-0,而突变体erf49与之相反。因此,AtERF49通过调控下游盐碱胁迫响应基因的表达以及植物的光合作用效率,改变参与植物对盐碱胁迫的应答。     

陆地棉GhPYR1基因的克隆和功能分析

植物激素脱落酸(Abscisic acid,ABA)在植物应对干旱、盐碱等逆境胁迫以及植物种子萌发、根伸长、芽休眠等阶段发挥重要作用。PYR/PYL/RCAR蛋白家族是ABA受体,与ABA结合后能够启动ABA信号传导通路,诱导ABA应答基因的表达。利用电子克隆和RT-PCR技术从陆地棉中克隆了Gh PYR1基因,其编码的Gh PYR1蛋白与拟南芥中At PYR1蛋白相似度为73%。将Gh PYR1蛋白序列与拟南芥14个PYR/PYL/RCAR家族成员蛋白序列进行比对并构建进化树,发现它与拟南芥PYR/PYL/RCAR蛋白亚家族III亲缘关系最近。过表达Gh PYR1基因的T3代拟南芥在外源ABA处理下,其种子萌发和初期根生长均滞后于野生型,表现出对ABA更加敏感;高盐和干旱胁迫对转基因种子的萌发抑制更强烈,但苗期胁迫处理下转基因拟南芥的长势却明显优于野生型;同时在外源ABA诱导条件下ABA应答基因RD29A、RAB18的表达量较野生型有明显提高。以上结果说明Gh PYR1基因编码的蛋白是ABA的受体,过表达该基因能够提高植物对ABA的敏感性和增强应对逆境胁迫的能力。     

玉米逆境响应相关转录因子ZmC2H2-1基因克隆及功能验证

玉米是我国第一大作物,提高玉米的抗逆性是玉米育种的重要目标性状之一。植物C2H2型锌指蛋白广泛参与植物各个时期的生长发育及逆境应答过程。本研究从玉米中分离了转录因子ZmC2H2-1基因并对其功能进行了初步研究。结果表明,ZmC2H2-1属于C2H2锌指蛋白转录因子家族,编码蛋白主要位于细胞核中,酵母自激活实验表明ZmC2H2-1不具有自激活活性;干旱、盐和ABA等逆境可抑制ZmC2H2-1基因在玉米中的表达;过表达ZmC2H2-1基因的拟南芥叶片失水速率更快,在PEG、高盐和ABA处理条件下,与对照相比转ZmC2H2-1基因拟南芥耐逆性降低,以上结果说明ZmC2H2-1基因是作为玉米抗逆的负调控因子参与了逆境胁迫应答。本研究为深入解析玉米ZmC2H2-1的调控网络和玉米的抗逆调控机制奠定了基础。     

超表达AVP1基因提高甜菜的耐低磷和耐盐抗旱性

为探讨H⁺-焦磷酸酶编码基因对甜菜磷吸收和抗性的影响，实现优良基因在甜菜基因工程中的利用，研究在甜菜中超表达拟南芥液泡膜H⁺-焦磷酸酶编码基因AVP1,对转基因甜菜分析其耐低磷、耐盐性和抗旱性。结果显示，AVP1基因在甜菜植株的叶片和块根中表达，且在逆境胁迫下增强表达量响应胁迫；低磷处理条件下，转基因甜菜与野生型甜菜相比具有更高的含磷量，可提高甜菜对磷的吸收利用效率；干旱、盐胁迫处理条件下，AVP1基因在转基因甜菜中显著上升，在盐胁迫或干旱处理条件下，转基因植株的生长受抑程度相对较轻。随着盐和干旱胁迫的加剧，转基因植株体内MDA含量与野生型植株相比较低而脯氨酸含量显著增加，AVP1基因可通过减轻逆境对甜菜细胞膜的损伤及提高甜菜细胞的渗透调节能力，进而增强甜菜对高盐和干旱胁迫的抗性。     

AtMYB77促进NO合成参与调控干旱胁迫下拟南芥侧根发育

转录因子MYB77与信号分子一氧化碳(NO)是侧根发育的重要调节因子, 但MYB77和NO在干旱胁迫下侧根发生中的作用及机制尚不明确。该文以拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型、AtMYB77缺失突变体Atmyb77-1及过表达株系AtOE77-1和AtOE77-3为材料, 研究了MYB77和NO在干旱胁迫下侧根发生中的作用。结果表明, AtMYB77受干旱胁迫诱导, AtMYB77缺失导致干旱胁迫下侧根发育相关基因CYCA2;1和CDKA;1表达下调, 同时Atmyb77-1的侧根数目和长度显著低于野生型, AtMYB77过表达则作用相反, 表明AtMYB77参与干旱胁迫下侧根发育的调控过程。干旱胁迫下, 拟南芥根系NO含量显著升高, NO合成关键酶NO合酶(NOS)和硝酸还原酶(NR)活性及基因表达上调, Atmyb77-1中NO含量、NOS和NR活性及基因表达量显著低于野生型, 而AtOE77-1和AtOE77-3根系NO含量及合成酶活性和基因表达量显著高于野生型。外施NO供体硝普钠(SNP)能缓解AtMYB77缺失对CYCA2;1和CDKA;1表达及侧根生长的抑制, NO清除剂或合成抑制剂则削弱AtMYB77过表达对侧根生长的促进作用。上述结果表明, AtMYB77通过促进NO合成参与干旱诱导的拟南芥侧根生长过程, 研究结果为深入解析干旱诱导侧根生长的信号转导机制和培育耐旱植物奠定了理论基础。     

谷子MYB类转录因子SiMYB42提高转基因拟南芥低氮胁迫耐性

Myeloblastosis (MYB)类转录因子是高等植物中最大的转录因子家族之一,在植物发育及防御反应过程中发挥重要作用,还参与植物对干旱等非生物胁迫的响应。谷子(Setaria italica L.)起源于中国,具有抗旱、耐瘠薄的特性,是研究单子叶作物非生物胁迫抗性的理想材料。本研究对耐低氮胁迫谷子品种郑204经低氮处理后进行转录组分析,鉴定出一个在低氮胁迫条件下明显上调的MYB类转录因子SiMYB42。系统发育树结果表明,SiMYB42属于R2R3-MYB亚族,具有2个MYB保守域;表达模式分析显示,SiMYB42在低氮、高盐、干旱和ABA胁迫条件下表达量显著上调;亚细胞定位、quantitative real-time PCR及转录激活活性分析结果表明,SiMYB42蛋白定位于植物的细胞核和细胞膜中,主要在谷子的叶部或根部表达,具有转录激活活性;基因功能分析结果表明,在正常条件下,转SiMYB42基因拟南芥与野生型Columbia-0拟南芥(WT)无明显差异,但在低氮条件下,转SiMYB42基因拟南芥的主根长、根系表面积及鲜重均显著高于WT,结果证明SiMYB42基因可以提高转基因植物对低氮胁迫的耐性;下游基因表达分析结果显示,在转SiMYB42基因拟南芥中,参与植物氮素转运的硝酸盐转运基因NRT2.1、NRT2.4和NRT2.5的表达水平均高于WT,启动子分析结果显示NRT2.1、NRT2.4和NRT2.5基因启动子序列中均具有MYB结合位点。以上结果证明,SiMYB42可以通过调控下游硝酸盐转运体基因的表达提高植物在低氮条件下的耐性。本研究揭示了SiMYB42基因在低氮胁迫反应途径中的作用,为进一步了解谷子低氮胁迫响应的调控网络奠定了基础。     

过表达兴安落叶松TPP基因增强拟南芥对盐胁迫的耐受能力*

兴安落叶松(Larix gmelinii)是极为重要的造林针叶树种,具有早期速生、抗逆性强、生态效益好等特点。海藻糖参与调控干旱、寒冷、盐害等多种逆境胁迫,海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)是海藻糖合成通路的重要酶。从兴安落叶松逆境胁迫转录组中筛选到LgTPPI.1基因全长序列,克隆了其编码区(CDS),构建了重组载体并获得过表达LgTPPI.1拟南芥纯合株系。结果表明,LgTPPI.1 CDS全长1 236 bp,共编码411个氨基酸;LgTPPI.1基因的mRNA在根和茎中表达水平较低,在针叶中表达水平较高;过表达LgTPPI.1基因拟南芥在盐胁迫下海藻糖含量显著提高、脯氨酸和抗氧化酶类活性增加、胁迫响应标记基因表达上调、对盐胁迫的耐受性增强。这些结果表明,裸子植物利用与被子植物类似的海藻糖通路来耐受非生物胁迫。为后续进一步解析落叶松中海藻糖合成相关基因的功能,揭示裸子植物中针叶树对逆境的响应机制奠定基础。     

玉米钼辅助因子硫酸化酶基因启动子的克隆与功能验证

为克服组成型启动子启动外源基因过量表达引起的诸多问题,同源克隆(Mo-molybdopterin cofactor sulfurase)基因（ABA3）的启动子(ABA3s)序列,并用PlantCARE软件分析其非生物逆境应答元件, 实时定量PCR检测ABA3基因在非生物逆境诱导下的差异表达后。然后,用该启动子构建启动GUS（β-glucuronidase）基因的表达载体, 基因枪法转化玉米愈伤组织。经组织化学染色法检测其表达后, 在高渗、高盐、低温胁迫处理及ABA诱导下检测GUS酶荧光值与荧光素酶(内参)发光值的比值(GUS/LUC), 以此评价ABA3s启动子在非生物逆境胁迫下的启动活性。结果表明, ABA3基因在模拟干旱、低温、高温、高盐胁迫及ABA、乙稀诱导下差异表达, 说明该基因的启动子(ABA3s)具有非生物逆境诱导活性。序列分析表明, ABA3s启动子全长777 bp, 含有ARE、HSE、MBS、TGA、Circadian等多种非生物逆境胁迫应答元件。用ABA3s启动GUS基因构建的表达载体转化的玉米愈伤组织, 响应干旱、低温、高温、高盐胁迫等多种非生物逆境胁迫, 及ABA和乙稀诱导, GUS检测呈阳性。在8%甘露醇高渗条件下, GUS/LUC比值比空白对照高6倍。上述结果表明, ABA3s启动子具有非生物逆境诱导特性, 经进一步验证其功能后, 可用于玉米抗逆转基因研究。     

干旱胁迫下拟南芥中H_2S与ABA信号关系研究

以野生型拟南芥(WT)、硫化氢(H_2S)合成酶缺失型突变体lcd、脱落酸(ABA)合成缺失型突变体aba1实生苗为材料,以0.3 mol·L^-1甘露醇模拟干旱胁迫,研究干旱胁迫对ABA含量、H_2S含量的影响,及其在拟南芥抵抗干旱胁迫中的作用及信号关系。结果显示:干旱胁迫显著提高LCD和ABA1基因相对表达以及H_2S含量,ABA含量;干旱胁迫显著抑制突变体lcd、aba1的种子萌发;干旱胁迫下,外施NaHS促进干旱胁迫下WT、lcd和aba1中內源H_2S的产生及上调LCD、ABA1基因相对表达,而外施ABA提高干旱胁迫下WT、aba1中H_2S含量及LCD、ABA1基因相对表达,但是对lcd中H_2S含量及LCD基因相对表达没有显著影响。研究结果表明,信号分子H_2S和ABA在拟南芥的干旱胁迫响应中发挥一定的作用,且H_2S位于ABA的下游参与调控拟南芥的信号过程。     

Arabidopsis U‐box E3 ubiquitin ligase PUB11 negatively regulates drought tolerance by degrading the receptor‐like protein kinases LRR1 and KIN7

Both plant receptor‐like protein kinases (RLKs) and ubiquitin‐mediated proteolysis play crucial roles in plant responses to drought stress. However, the mechanism by which E3 ubiquitin ligases modulate RLKs is poorly understood. In this study, we showed that Arabidopsis PLANT U‐BOX PROTEIN 11 (PUB11), an E3 ubiquitin ligase, negatively regulates abscisic acid (ABA)‐mediated drought responses. PUB11 interacts with and ubiquitinates two receptor‐like protein kinases, LEUCINE RICH REPEAT PROTEIN 1 (LRR1) and KINASE 7 (KIN7), and mediates their degradation during plant responses to drought stress in vitro and in vivo. pub11 mutants were more tolerant, whereas lrr1 and kin7 mutants were more sensitive, to drought stress than the wild type. Genetic analyses show that the pub11 lrr1 kin7 triple mutant exhibited similar drought sensitivity as the lrr1 kin7 double mutant, placing PUB11 upstream of the two RLKs. Abscisic acid and drought treatment promoted the accumulation of PUB11, which likely accelerates LRR1 and KIN7 degradation. Together, our results reveal that PUB11 negatively regulates plant responses to drought stress by destabilizing the LRR1 and KIN7 RLKs.     

白桦BpPIN3基因启动子序列及应答特性分析

PIN蛋白家族作为植物中重要的生长素外排载体家族,在植物生长和发育过程中表现出广泛的生理效应。为了进一步了解BpPIN3的功能,探究其在白桦（Betula platyphylla）发育过程中及其对不同激素信号和非生物胁迫的响应,采用生物信息学方法分析白桦BpPIN3启动子序列。以1年生和2年生白桦无性系苗木的根、茎、叶和顶芽为材料进行组织部位表达模式分析。以白桦幼苗为材料,用100 μmol·L^-1生长素（IAA）、100 μmol·L^-1赤霉素（GA₃）、200 μmol·L^-1脱落酸（ABA）和长光照条件下分别进行激素诱导和光胁迫处理,并取激素处理后0、2、4、8、16、24、48 h以及光胁迫后0、1、3、6,12、24、48、72 h时的白桦叶片和根提取RNA,利用qRT-PCR技术分析BpPIN3基因的表达情况。结果显示：BpPIN3启动子序列包含赤霉素、脱落酸、茉莉酸甲酯等不同类型的生长素响应元件,以及多个与逆境相关的顺式调控元件。BpPIN3在不同生长年份白桦的多个组织部位都有表达,尤其在叶片中表达量较高,并且所有组织部位中BpPIN3第二年的表达量均高于第一年。BpPIN3基因在不同处理条件下,不同部位间的相对表达量的变化存在一定差异,IAA及GA能够诱导白桦叶片组织细胞中的BpPIN3上调表达;而在ABA处理下除16、48 h外,BpPIN3基因表现出与IAA处理下相反的表达模式。在根组织中,IAA、GA₃及ABA均能诱导BpPIN3的表达。在叶片组织中,遮光胁迫诱导了BpPIN3基因的表达;在根组织中,随着处理时间的推移,12 h开始BpPIN3基因的相对表达量均显著高于对照（0 h）。根据试验结果,推测BpPIN3基因在白桦生长发育过程,以及IAA、GA₃和ABA信号转导途径和植物光响应过程中发挥重要调控作用。     

BAK1 plays contrasting roles in regulating abscisic acid-induced stomatal closure and abscisic acid-inhibited primary root growth in Arabidopsis

The mechanisms that balance plant growth and stress responses are poorly understood, but they appear to involve abscisic acid (ABA) signaling mediated by protein kinases. Here, to explore these mechanisms, we examined the responses of Arabidopsis thaliana protein kinase mutants to ABA treatment. We found that mutants of BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED RECEPTOR KINASE 1 (BAK1) were hypersensitive to the effects of ABA on both seed germination and primary root growth. The kinase OPEN STOMATA 1 (OST1) was more highly activated by ABA in bak1 mutant than the wild type. BAK1 was not activated by ABA treatment in the dominant negative mutant abi1-1 or the pyr1 pyl4 pyl5 pyl8 quadruple mutant, but it was more highly activated by this treatment in the abi1-2 abi2-2 hab1-1 loss-of-function triple mutant than the wild type. BAK1 phosphorylates OST1 T146 and inhibits its activity. Genetic analyses suggested that BAK1 acts at or upstream of core components in the ABA signaling pathway, including PYLs, PP2Cs, and SnRK2s, during seed germination and primary root growth. Although the upstream brassinosteroid (BR) signaling components BAK1 and BR INSENSITIVE 1 (BRI1) positively regulate ABA-induced stomatal closure, mutations affecting downstream components of BR signaling, including BRASSINOSTEROID-SIGNALING KINASEs (BSKs) and BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE 2 (BIN2), did not affect ABA-mediated stomatal movement. Thus, our study uncovered an important role of BAK1 in negatively regulating ABA signaling during seed germination and primary root growth, but positively modulating ABA-induced stomatal closure, thus optimizing the plant growth under drought stress.     

葡萄NCED基因家族进化及表达分析

9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是植物体内ABA生物合成的关键限速酶, 参与植物对干旱、外源ABA和高盐的响应过程, 降低环境胁迫对植株的危害。基于全基因组鉴定分析葡萄(Vitis vinifera) NCED基因家族成员, 探讨各成员的物种进化关系及各个基因成员在不同组织中的时空表达模式及对干旱、ABA和高盐(NaCl)胁迫的响应, 为进一步揭示该基因家族成员的生物学功能奠定基础。在葡萄基因组中共发现12个NCED基因。其推测的编码蛋白质长度在510 (VvNCED2)-625 aa (VvNCED10)之间。VvNCED蛋白的分子量最大值是70.53 kDa (VvNCED10), 最小值是57.85 kDa (VvNCED2)。在从祖先基因分化之后, 葡萄NCED基因发生了5次复制事件, 同时有2次丢失事件。NCED1/2、NCED3/4、NCED6/7和NCED9/10基因对被认为是通过片段复制产生。上述4对复制基因复制时间分布在3.08-120.0百万年前, 晚于单双子叶植物分化的时间。与对照相比, VvNCED1在ABA处理48小时后显著上调(72.1%), 而VvNCED2显著下调(84.0%)。VvNCED6只在干旱处理14、21和28天的根系中表达量高于对照, 分别为对照的2.49、1.05和1.09倍。VvNCED7只在干旱处理14天的根系中表达量高于对照, 为对照的1.07倍。在ABA处理72小时后, VvNCED3表达量较对照显著下调(59.5%), 而VvNCED4较对照显著上调(169.9%)。VvNCED3/VvNCED4分别在NaCl处理24和48小时出现显著性峰值, 较对照分别上调219.2%和114.4%。保守结构域不同组成和不同胁迫处理下差异表达模式是NCED蛋白发生功能分化的基础。推测NCED在进化过程中发生的功能分化有利于复制事件的发生。     

葡萄NCED基因家族进化及表达分析

9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是植物体内ABA生物合成的关键限速酶, 参与植物对干旱、外源ABA和高盐的响应过程, 降低环境胁迫对植株的危害。基于全基因组鉴定分析葡萄(Vitis vinifera) NCED基因家族成员, 探讨各成员的物种进化关系及各个基因成员在不同组织中的时空表达模式及对干旱、ABA和高盐(NaCl)胁迫的响应, 为进一步揭示该基因家族成员的生物学功能奠定基础。在葡萄基因组中共发现12个NCED基因。其推测的编码蛋白质长度在510 (VvNCED2)-625 aa (VvNCED10)之间。VvNCED蛋白的分子量最大值是70.53 kDa (VvNCED10), 最小值是57.85 kDa (VvNCED2)。在从祖先基因分化之后, 葡萄NCED基因发生了5次复制事件, 同时有2次丢失事件。NCED1/2、NCED3/4、NCED6/7和NCED9/10基因对被认为是通过片段复制产生。上述4对复制基因复制时间分布在3.08-120.0百万年前, 晚于单双子叶植物分化的时间。与对照相比, VvNCED1在ABA处理48小时后显著上调(72.1%), 而VvNCED2显著下调(84.0%)。VvNCED6只在干旱处理14、21和28天的根系中表达量高于对照, 分别为对照的2.49、1.05和1.09倍。VvNCED7只在干旱处理14天的根系中表达量高于对照, 为对照的1.07倍。在ABA处理72小时后, VvNCED3表达量较对照显著下调(59.5%), 而VvNCED4较对照显著上调(169.9%)。VvNCED3/VvNCED4分别在NaCl处理24和48小时出现显著性峰值, 较对照分别上调219.2%和114.4%。保守结构域不同组成和不同胁迫处理下差异表达模式是NCED蛋白发生功能分化的基础。推测NCED在进化过程中发生的功能分化有利于复制事件的发生。