水稻锌指蛋白基因O_sBBX22响应热胁迫的功能分析

利用RNA干涉技术研究水稻锌指蛋白基因O_sBBX22的生物学功能,为探讨O_sBBX22响应热胁迫的机制、培育抗逆水稻、减轻高温对水稻的损害奠定基础。通过观察转基因突变体植株和野生型植株在热胁迫下的表型差异,分析O_sBBX22生物学功能;采用半定量PCR和荧光定量PCR检测O_sBBX22以及相关的热激转录因子(HSF)、热激蛋白(HSP)基因在转基因突变体株系中的表达水平;通过原位组织化学检测过氧化氢在野生型、转基因突变体株系叶片中的定位和积累情况。结果表明,在0~5 h热胁迫条件下,与野生型株系相比,O_sBBX22的表达在转基因突变体植株中明显下调;而野生型O_sBBX22受热信号诱导,随着热激时间的增加,O_sBBX22的表达量呈先上升后下降的趋势,且在热激1 h时表达量最高。相关的HSF和HSP也受热信号诱导,野生型株系中的HSFA2a、HSFA7、HSP16.9和HSP100表达量均比转基因突变体株系高,且在热激1 h时,HSFA2a、HSP16.9和HSP100表达量最高,而HSFA7在热激3 h时表达最高。热胁迫3 h,经DAB染色,转基因突变体株系叶片上出现的红褐色斑点主要集中于叶脉和受损伤部位,且明显多于野生型。锌指蛋白基因O_sBBX22在水稻苗期热胁迫应答中具有重要的作用,野生型株系抗热能力明显高于O_sBBX22抑制表达转基因株系;HSFA2a、HSFA7、HSP16.9和HSP100可能参与了O_sBBX22介导的水稻耐热调控。     

CRISPR/Cas9介导的水稻OsRhoGAP2基因的敲除

OsRhoGAP2是通过酵母双杂交从水稻幼穗组织分离的一种Rho GTP酶激活蛋白质编码基因,其功能尚不明确。为鉴定该基因的功能,本研究采用CRISPR/Cas9技术构建了OsRhoGAP2基因单靶标敲除载体,并转化日本晴水稻。对转基因水稻的筛选以及编辑靶点扩增和测序结果表明,在T_0代获得3种杂合突变体,在T_1代获得2种纯合突变体,命名为株系1和株系16。2个纯合敲除株系在OsRhoGAP2编辑靶点分别缺失2个和1个碱基,均导致该基因的移码突变并最终造成无义突变。序列分析显示,突变体中预期生成的OsRhoGAP2截短蛋白质丧失了保守的RhoGAP结构域及CRIB基序。抽穗期水稻的叶片扫描电镜观察结果显示,株系1的叶片表皮毛大量缺失;对抽穗期水稻的剑叶进行光合指标测量,发现突变体与野生型在净光合速率与气孔导度上存在显著差异。其中,株系1和株系16的净光合速率分别上升17.79%和7.70%,气孔导度分别上升113.10%和64.50%,提示OsRhoGAP2基因的功能可能涉及这些生物学过程。     

水稻OsYABBY6基因参与叶片发育的初步研究

水稻YABBY基因家族在植物侧生器官发育过程中起着重要调控作用。在研究中,采用合成型转录因子的方法将转录抑制结构域EAR融合于OsYABBY6的C-端,获得转基因株系CE-OsYABBY6。表型分析发现,转基因株系CE-OsYABBY6-16和CE-OsYABBY6-19成熟期的剑叶均明显表现出朝近轴面卷曲,其卷曲指数相比于野生型均显著提高(P0.05),说明OsYABBY6参与了水稻叶的发育调控。进一步的细胞组织学分析发现,与野生型相比,CE-OsYABBY6-16叶片横切面中的泡状细胞束的总数、非正常泡状细胞束的数量和比率均显著增加,说明OsYABBY6蛋白与泡状细胞的发育相关。同时,转基因株系CE-OsYABBY6中细胞周期及细胞伸长相关基因的转录水平显著升高,说明OsYABBY6对细胞分裂及生长产生了影响,最终导致了叶片发育的异常。总之,水稻转录因子OsYABBY6参与了叶的近-远轴发育调控,尤其是叶片近轴面的发育调控,而且是泡状细胞发育和叶片伸展所必需的。     

RNAi介导的OsBTF3基因沉默及其对水稻籽粒相关性状的影响

为了创制OsBTF3基因沉默的水稻植株、验证该基因在水稻籽粒相关性状中的功能、评价其在水稻遗传改良中潜在的应用价值,设计和合成OsBTF3基因序列的引物、扩增部分基因片段,构建RNAi基因沉默载体、通过农杆菌介导转化愈伤组织、植株再生、潮霉素抗性筛选和PCR验证、定量分析OsBTF3基因表达量,测定转基因水稻籽粒相关性状。结果表明,成功地获得了20个T1代OsBTF3-RNAi转基因株系,OsBTF3基因表达量得到显著的抑制和干扰,抑制效果平均达到85%;与野生型对照株相比,5个所测定RNAi转基因株系的穗长、穗粒数、千粒重和穗粒重等籽粒相关性状明显地减小或降低。因此,RNAi介导的基因沉默导致了OsBTF3基因表达水平抑制以及在籽粒性状中的功能缺失;OsBTF3可能是一个调控水稻籽粒相关性状重要的功能基因。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻ROP基因OsRac5

OsRac5基因属于水稻小G蛋白ROP家族。该基因参与了水稻的育性调节,但是OsRac5在水稻生长发育中的作用尚不清楚。为鉴定该基因的功能,本文采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,构建了该基因的双靶标载体Cas9-OsRac5,并对水稻进行了遗传转化。对转基因水稻的筛选和分子鉴定显示,在T1代获得了10个纯合突变株系。序列分析显示,在OsRac5编辑水稻中,该基因编码区发生了碱基缺失或/和插入,导致预期产生的不同类型OsRac5截短蛋白均丧失小G蛋白的保守结构域。对抽穗期OsRac5编辑水稻的表型进行统计学分析,结果显示,OsRac5编辑水稻与对照在剑叶角度以及剑叶净光合速率上存在极显著差异,其中OsRac5编辑水稻剑叶角度增大67%,剑叶净光合速率减小32.7%。本研究结果提示,OsRac5基因通过调控剑叶角度,影响水稻光合效率,与水稻生长发育密切相关。     

染色体重组对转基因大麦中gfp基因表达的作用

利用5种转绿色荧光蛋白基因(gfp)大麦不同株系及野生型大麦为材料,对不同转基因株系间以及转基因株系与野生型植株间进行杂交,分别对不同世代植株的根尖、花粉中gfp基因的表达量进行测定.结果表明,不同转基因株系间的根尖、花粉的gfp基因在表达量上存在差异,同一转基因材料的gfp基因表达存在组织差异;gfp基因在杂交后代中作为一个显性基因以孟德尔方式稳定遗传,不同染色体上的gfp基因重组有利于提高持基因表达.     

基因枪转化的bar基因表达盒在水稻中遗传行为复杂

基因枪介导基因表达盒(仅包括启动子、编码区和终止子)转化是基因枪转化植物的新趋势,它能消除质粒载体主干序列对转基因植物的不利影响。本文研究了基因枪转化的bar基因表达盒在转基因水稻T1～T3世代中的遗传行为。结果发现:作为筛选标记的bar基因表达盒在水稻基因组中多拷贝整合,遗传分离行为复杂,还出现了Basta抗感分离比在35:1～144:1之间的"假纯合体",但50%转基因株系中(5/10)bar基因可作为一个显性基因按孟德尔方式稳定遗传至自交T2代。虽然bar基因为多拷贝整合,30%的转基因株系(3/10)在自交低世代(T1)能获得纯合体。Southern杂交分析发现,多拷贝的bar基因表达盒倾向于连接成转基因串联子整合在水稻基因组内。我们发现在Basta抗性正常分离的株系后代中bar基因表达盒Southern杂交模式能稳定遗传,但异常分离的株系后代中bar基因表达盒的一些拷贝发生了丢失。我们推测,bar基因表达盒在水稻中遗传分离行为的复杂原因可能是bar基因表达盒多拷贝整合、基因丢失和基因表达互作。     

拟南芥热激转录因子耐高温功能分析

从拟南芥基因组中克隆了热激转录因子(At Hsf A6a),构建了过量表达(over-expression,OE)和反义(anti-sense,AS)植物表达载体并转化拟南芥,获得了拟南芥纯合转基因株系。对其进行耐高温处理,结果显示:43℃处理2 h,过量表达转基因植株存活率(86%)远高于野生型(59%);而反义转基因植株存活率则只有43%,显著低于野生型。43℃处理0.5 h,过量表达转基因植株的离子渗漏水平显著低于野生型,而反义转基因植株则大幅度升高。基因表达分析证明,AtHsfA6a的表达受热胁迫诱导,并且Hsp70是受AtHsfA6a调控的下游靶基因。上述结果表明,拟南芥AtHsfA6a可能通过调节Hsp70表达,提高植物耐受高温胁迫的能力。     

PTLF-PTAG-IR对转基因烟草开花的抑制效应

PTLF(LEAFY同源基因)和PTAG(AGAMOUS同源基因)是杨树中控制花发育的重要基因,为了解RNA干涉同时抑制PTLF和PTAG对花发育的影响,本研究采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将35S::PTLF-PTAG-IR导入烟草(Nicotiana tabacum)。经PCR检测获得了15株阳性转化株系,进一步的Southern分析证实PTLF-PTAG-IR基因已整合到烟草基因组中。荧光定量分析结果显示,转基因烟草内源NFL(LEAFY同源基因)和NAG1(AGAMOUS同源基因)的表达量均低于野生型。对开花时间调查的结果表明:与野生型烟草相比,53.3%的转基因株系开花受到完全的抑制,26.7%的转基因株系开花时间平均推迟34.3d,仅20%的转基因株系与野生型在同一时期开花。另外,对转基因烟草花器官的观察发现花瓣形态,雄蕊着生方式、数目等方面发生变异,这些研究结果表明过量表达35S::PTLF-PTAG-IR对烟草花发育起到抑制作用,本研究将为利用转基因手段获得不育材料提供参考。     

AtNHX5基因过量表达对拟南芥耐盐性的影响

为了研究AtNHX5基因在植物耐盐中的作用,构建了植物过量表达载体pROKⅡ-AtNHX5,并转化拟南芥。结果显示:(1)RT-PCR检测表明,转基因拟南芥中AtNHX5基因的表达大幅提高。(2)对转基因纯合株系进行耐盐性分析显示,AtNHX5过量表达提高了植株在种子萌发和苗期的耐盐性。(3)转基因植株在盐处理下的干重、鲜重以及地上部分Na+、K+含量均高于野生型对照。在200mmol/L NaCl处理下,以转基因株系a1-4为例,其地上部分单株鲜重、单株干重、K+含量分别是野生型的1.27、1.54、1.16倍,较野生型显著升高。研究表明,过量表达AtNHX5基因促进了盐胁迫下转基因植株对K+的吸收,转基因拟南芥的耐盐性明显提高。     

Development of transgenic rice pure lines with enhanced resistance to rice brown planthopper

Summary Mature seed-derived callus from an elite Chinese japonica rice cv. Ewan 5 was cotransformed with two plasmids, pWRG1515 and pRSSGNAl, containing the selectable marker hygromycin phosphotransferase gene (hpt), the reporter β-glucuronidase gene (gusA) and the snowdrop (Galanthus nivalis) lectin gene (gna) via particle bombardment. Thirty-five independent transgenic rice plants were regenerated from 177 bombarded calluses. Eighty-three percent of the transgenic plants contained all three genes, as revealed by Southern blot analysis. Western blot analysis revealed that 23 out of 29 gna-containing transgenic plants expressed Galanthus nivalis agglutinin (GNA) (79%) at various levels, with the highest expression being approximately 0.5% of total soluble protein. Genetic analysis confirmed Mendelian segregation of all three transgenes (gna, hpt and gusA) in the R2 progeny. Amongst the R2 generation two independent homozygous lines were identified that expressed all three transgenes. Insect bioassay and feeding tests showed that these homozygous lines had significant inhibition to rice brown planthopper (Nilaparvata lugens, BPH) by decreasing the survival, overall fecundity of BPH, retarding development, and decreasing the feeding of BPH. These BPH-resistant lines have been incorporated into a rice insect resistance breeding program. This is the first report that homozygous transgenic rice lines expressing GNA, developed by genetic transformation and through genetic analysis-based selection, conferred enhanced resistance to BPH.     

蓝细菌PCC6803染色体上的毒素蛋白Slr0664与抗毒素蛋白Ssr1114的相互作用

【目的】证明蓝细菌PCC6803染色体上的毒素-抗毒素系统(TA,toxin-antitoxin system)ssr1114/slr0664中毒素蛋白Slr0664与抗毒素蛋白Ssr1114之的相互作用。【方法】构建在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中诱导表达H6-Ssr1114或共表达H6-Ssr1114和Slr0664的重组质粒,诱导表达后借助亲和捕捉技术在不同的条件下纯化H6-Ssr1114或共纯化重组蛋白H6-Ssr1114和Slr0664,并通过肽谱分析共纯化的重组蛋白,证明H6-Ssr1114与Slr0664之间存在相互作用。【结果】诱导Slr0664表达对细胞产生毒性作用导致生长抑制或细胞死亡,诱导H6-Ssr1114和Slr0664共表达时细胞能能正常生长,在非变性条件下可纯化共表达的重组蛋白H6-Ssr1114和Slr0664,在变性条件下仅H6-Ssr1114被纯化,肽谱分析结果表明共纯化的的重组蛋白为H6-Ssr1114和Slr0664。【结论】ssr1114/slr0664TA系统中抗毒素蛋白Ssr1114与毒素蛋白Slr0664之间存在相互作用。     

集胞藻PCC 6803中脂肪酸激活酶Slr1609互作蛋白的鉴定

集胞藻中slr1609是编码脂肪酸激活酶的基因,对与其相关的重要功能伴侣蛋白进行研究,可以完善对脂肪酸合成模块的认识,为进一步通过合成生物学技术改造蓝细菌提供理论支持。本研究在集胞藻PCC 6803中建立了蛋白质复合体分析及鉴定技术:利用氯霉素抗性基因筛选,构建带有3×FLAG标签的Slr1609突变株,通过RT-PCR优化重组蛋白表达条件;同时对突变株进行了Western blotting鉴定,以及利用Native-PAGE验证了蛋白质复合体的存在。最后,LC-MS/MS质谱鉴定获得了Slr1609蛋白复合体中的可能伴侣蛋白。     

转基因培育抗除草剂水稻

以ｐＡＨＣ２０（含Ｂａｒ基因）和ｐＷＲＧ１５１５（含ＧＵＳ基因和潮霉素抗性基因）以及含Ｂａｒ基因和雪莲凝集素（ＧＮＡ）基因的ｐＣＡＭＢＩＡ３３００ ＲＧ为供体ＤＮＡ,选用水稻品系８７２０３、上农香糯及鄂宜１０５的成熟胚诱导出的愈伤组织及微不定芽为受体材料,分别采用基因枪和根癌农杆菌（ＬＢＡ４４０４,含ｐＡＬ４４０４）导入法进行基因转化;经抗性筛选、ＧＵＳ检测和ＰＣＲ分析。结果表明,外源基因已通过基     

Enhanced Expression of an Iron–Sulfur Protein Slr0351 of <Emphasis Type="Italic">Synechocystis</Emphasis> sp. PCC 6803 in <Emphasis Type="Italic">E. coli</Emphasis> by Truncating the Transmembrane Region

Iron–sulfur proteins are important components of the photosynthetic electron transport complex in thylakoid membrane of cyanobacteria. The aim of this study was to enhance the expression of a putative iron–sulfur protein Slr0351 in E. coli by truncating the transmembrane region and to explore the iron–sulfur cluster binding properties of Slr0351. We truncated the N-terminal transmembrane region of Slr0351 (sample Slr0351_tr), which resulted in higher yield and higher solubility of Slr0351_tr expressed in E. coli BL21 (DE3) without supplementation of Fe²⁺ and S^2– in LB media, compared with the full-length Slr0351. Using affinity chromatography under anaerobic conditions, we obtained purified Slr0351 and Slr0351_tr. Unlike full-length Slr0351, Slr0351_tr was of brown color and showed distinct absorption peak at 460 nm, which is characteristic of Fe/S cluster. To identify the binding cysteine site of Fe/S cluster in Slr0351_tr, we obtained four mutants of Slr0351_tr via site-directed mutagenesis. The binding sites were identified as C140, C141, and C288 based on disappearance of the absorbance at 460 nm characteristic of the mutants. These results confirm that Slr0351 is an iron–sulfur protein.     

Synthesis of cyclic di-nucleotidic acids as potential inhibitors targeting diguanylate cyclase

Five analogs of cyclic di-nucleotidic acid including c-di-GMP were synthesized and evaluated for their biological activities on Slr1143, a diguanylate cyclase of Synechocystis sp. Slr1143 was overexpressed from the recombinant plasmid which contained the gene of interest and subsequently purified by affinity chromatography. A new HPLC method capable of separating the compound and product peaks with good resolution was optimized and applied to the analysis of the compounds. Results obtained show that cyclic di-inosinylic acid 1b demonstrates a stronger inhibition on Slr1143 than c-di-GMP and is a potential inhibitor for biofilm formation.     

细胞质雄性不育辣椒育性恢复基因特异分子标记的筛选

利用集团分离分析法(Bulked segregant analysis BSA),以辣椒细胞质雄性不育系BU-12、恢复系RF-12为材料共筛选了336条RAPD引物,其中引物S418在恢复系中呈现特异性扩增,得到一条约3000bp的特异片段。回扩得到两条片段,测序表明大小为1515bp,1162bp。荧光原位杂交证实1515bp片段为恢复系特有,命名为S418_(1515)。序列分析表明S418_(1515)为一新发现的序列,Blastn序列比对同源性小于40%,tBlastx比对发现该序列与水稻2、4、7、10号染色体的几个BAC克隆上的序列高度同源。推测可能与其具有相似的编码功能,为进一步从分子水平研究辣椒育性恢复打下了坚实的基础。根据测序结果设计特异引物,将S418_(1515)转化成特异PCR标记,证明能用于候选材料的初筛。     

Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803

We investigated the spectrum of secreted proteins in the cyanobacterium Synechocystis, and identified these proteins by amino-terminal sequencing. In total, seven sequences have been determined that corresponded to the proteins Sll0044, Sll1694, Sll1891, Slr0924, Slr0841, Slr0168, and Slr1855. The protein Sll1694 of 18 kDa that formed one of two major bands on SDS-PAGE was identified as cyanobacterial pilin, PilA. The amino-terminal sequence of another protein that formed a second major band was blocked. The analysis of the data revealed that five of seven proteins had distinct putative leader sequences for secretion.     

细胞质雄性不育辣椒育性恢复基因特异分子标记的筛选

利用集团分离分析法(Bulked segregant analysis BSA),以辣椒细胞质雄性不育系BU-12、恢复系RF-12为材料共筛选了336条RAPD引物,其中引物S418在恢复系中呈现特异性扩增,得到一条约3000bp的特异片段。回扩得到两条片段,测序表明大小为1515bp,1162bp。荧光原位杂交证实1515bp片段为恢复系特有,命名为S4181515。序列分析表明S4181515为一新发现的序列,Blastn序列比对同源性小于40％,tBlastx比对发现该序列与水稻2、4、7、10号染色体的几个BAC克隆上的序列高度同源。推测可能与其具有相似的编码功能,为进一步从分子水平研究辣椒育性恢复打下了坚实的基础。根据测序结果设计特异引物,将S4181515转化成特异PCR标记,证明能用于候选材料的初筛。