氟代糖在糖苷酶研究中的应用

近年来,氟代糖应用于糖苷酶反应研究,显示出越来越重要的作用。氟代糖可以作为糖苷酶及其突变酶的水解底物研究酶学性质;氟代糖抑制剂可以标记糖苷酶催化中心,鉴定亲核体氨基酸。尤为重要的是,氟代糖可作为糖苷酶的糖基供体来合成糖类。糖苷酶突变后,可生成糖苷合成酶和硫代糖苷合成酶,可以用与正常底物构型相反的氟代糖作为糖基供体高效合成糖类,收率一般为60%~90%,有的可达100%。糖苷酶及其突变酶以氟代糖为底物高效合成糖类的研究,必将促进生物学、糖生物学和纳米生物材料的发展。     

D-泛解酸内酯水解酶的定向进化

易错PCR结合DNA改组方法向D-泛解酸内酯水解酶基因中引入突变,并构建突变体库。利用酶的催化特点和产物特性建立了基于平板初筛和高效液相复筛的两步法D-泛解酸内酯水解酶活性筛选系统。用该筛选系统以酶活力和pH稳定性为指标对突变体库进行筛选,最终获得一株酶活力高且在低pH条件下稳定性好的突变体Mut E-861。该突变体的酶活力是野生型酶的5.5倍。对突变体和野生型酶在pH 6.0和pH 5.0条件下的残余酶活进行对比,在这两种pH条件下,突变体酶的酶活残留分别为75%和50%,而野生型酶只能保持原来的40%和20%。通过软件对突变体Mut E-861酶基因和野生型酶基因进行分析对比,发现突变体Mut E-861酶基因发生了三处点突变,其中突变使两处氨基酸取代,另一处为沉默突变,未引起氨基酸的变化。     

大肠杆菌碱性磷酸酶的体外定向进化研究

大肠杆菌碱性磷酸酶（E.coli alkaline phosphatase, EAP, EC 3.1.3.1）是一个非特异性二聚体磷酸单酯酶. 采用易错聚合酶链反应(error prone PCR)的方法,在原有高活力突变株的基础上,对EAP远离活性中心催化三联体的区域进行定向进化,经两轮error prone PCR,获得催化活力较亲本D101S突变株提高3倍、较野生型酶提高35倍的进化酶4-186,并对该酶的催化动力学特征进行了分析. 进化酶基因的DNA测序表明4-186含两个有义氨基酸置换：K167R和S374C,二者既不位于底物结合位点,也不位于酶的金属离子结合位点.     

酶法合成功能性低聚糖

功能性低聚糖具有无毒、无残留、稳定性强等特点,作为新型绿色添加剂被广泛应用在食品、饲料、医药行业。国际市场上10余种低聚糖产品中除大豆低聚糖、棉籽糖外,主要采用酶法制备。用于合成功能性低聚糖的酶包括糖苷酶、糖基转移酶和磷酸化酶。本文综述了功能性低聚糖种类、性质和制备方法,分析了酶法合成低聚糖的优缺点,阐述了磷酸化酶种类、催化特性和低聚糖产物。多酶法合成策略和目标酶的分子改造将是酶法合成功能性低聚糖的发展方向。     

定点突变对酰胺水解酶DamH可溶性表达和酶活的影响

摘要:【目的】DamH是一种具有酯酶活性的酰胺水解酶,其非活性中心氨基酸残基的突变对重组酶可溶性表达和比酶活产生一定的影响。拟探索DamH的活性中心氨基酸残基构成,并对其非活性中心氨基酸残基突变对可溶性表达和比酶活的影响进行研究。【方法】通过重叠延伸的方法对DamH可能的活性中心氨基酸S149、E244和H274以及非活性中心氨基酸D165及N192进行定点突变,通过静息细胞测活验证了S149、E244和H274 在催化2-氯-N-(2’-甲基-6’-乙基苯基)乙酰胺(CMEPA)水解反应中的作用,通过Ni2+- NTA亲和层析对D165及N192突变子进行纯化,对突变株和野生型比酶活进行比较。【结果】研究表明S149A使DamH的CMEPA 水解酶活性下降为野生型的5%,E244A和H274A突变导致其失去活性;D165P和N192P突变影响到DamH的可溶性表达,表达量分别为野生型的28.2%和20.8%,突变子N192P、D165P比酶活分别为野生型比酶活的55.5%和49.7%。【结论】DamH催化酯类底物和芳基酰胺类底物可能共用同一活性中心S149、E244和H274,其两个α螺旋的转角处氨基酸侧链极性和刚性结构的改变对可溶性表达以及活性有很大的影响。     

糖苷合成酶——— 一类新型的寡糖高效合成工具

寡糖是哺乳动物细胞表面糖蛋白和糖脂以及微生物来源的生理活性物质的要素之一,其应用于医药的巨大潜能至今还没有得到充分体现,主要原因是合成足够于临床使用的寡糖非常困难.传统的化学法和酶法在大规模合成寡糖方面都有一定局限性.近年来,分子生物学技术大大推动了糖苷酶合成寡糖的研究,将糖苷酶催化中心亲核体氨基酸定点突变为非亲核体氨基酸,导致酶的原有水解活性丧失,只催化糖苷键合成反应,寡糖产量最高可达99%,人工产生了一类新酶——糖苷合成酶(glycosynthases),随后又产生了硫代糖苷酶(thioglycoligases)和硫代糖苷合成酶(thioglycosynthases).糖苷合成酶的高通量筛选可用双质粒系统和酵母三杂交系统进行,其活性的进一步改进可通过亲核体氨基酸位点不同氨基酸取代、其他位点氨基酸突变、反应条件优化等方法进行,其区域选择性的改变或增强可通过改变糖基受体分子达到.糖苷合成酶作为一种新型高效的生物催化剂,对寡糖的工业化合成有着重要意义,它的出现对糖生物学的发展必将起到巨大的推动作用.     

β-N-乙酰氨基己糖苷酶及其合成寡糖的研究进展

β-N-乙酰氨基己糖苷酶(EC.3.2.1.52)是一类重要的糖苷水解酶,在自然界中催化简单的β-N-乙酰氨基己糖苷或复杂的寡糖链、多糖链中末端N-乙酰己糖苷键的水解,在微生物、植物和动物中广泛分布,具有重要的生物学功能。某些种类的β-N-乙酰氨基己糖苷酶在一定的人为条件下水解β-N-乙酰氨基己糖苷键的同时还具有转糖基作用,能将β-N-乙酰氨基己糖基转移到不同的羟基化合物上,合成β-N-乙酰氨基己糖苷化合物,在糖链合成上具有应用的潜力。本文综述了β-N-乙酰氨基己糖苷酶的结构和催化机制、酶的生物学功能以及酶在β-N-乙酰氨基己糖苷化合物合成中的应用,以促进β-N-乙酰氨基己糖苷酶的进一步研究和开发应用。     

耐高温β-糖苷酶的乳糖水解活性及转糖基活性

β-糖苷酶（ttβGLY）是Thermus thermophilus产生的一种耐高温酶,以乳糖为底物的酶反应研究表明：该酶具有较高的乳糖水解活性,其最适温度为70℃,最适pH为7．0,乳糖水解的Km=1．566mmol／L,Vmax=0．406mmol／min,在70℃有较好的热稳定性。该酶同时具有较强的转糖基活性,在以40％乳糖为底物,加酶量42．5U／mL、反应温度70℃、反应时间16h的条件下,低聚半乳糖的合成率达到35．3％。水解产物葡萄糖对乳糖水解反应和转糖基反应具有抑制作用,是影响GOS合成的重要因素。     

环果寡糖果糖基转移酶研究进展

环果寡糖果糖基转移酶(CFT酶)是一种多功能型酶,能催化三种转糖基反应(环化、歧化和耦合)以及水解反应,而其中能将菊糖水解为环果寡糖的环化反应是其特征性反应。环果寡糖的独特结构使其在医药、化工等领域具有潜在应用价值。简要论述了环果寡糖的结构和应用,重点论述了环果寡糖果糖基转移酶的酶学性质、基因克隆和表达,以及功能和催化机理等方面的最新研究进展。     

基于易错PCR定向进化扩展青霉 Penicillium expansum FS1884碱性脂肪酶

为改善扩展青霉FS1884碱性脂肪酶的活性及酶学性质,利用连续两轮易错PCR对扩展青霉FS1884脂肪酶基因PEL进行随机突变,在大肠杆菌JM109中构建突变文库。含突变脂肪酶基因的重组质粒电击转化巴斯德毕赤酵母GS115,经过YPOM板初筛和橄榄油检验板复筛,获得一株酶活性提高的脂肪酶突变体:PEL-ep25-GS。与野生型脂肪酶PEL-GS相比,在最适温度40℃、pH9.4时突变体的酶活力是野生型酶的1.3倍。测序结果表明:该突变体第253位氨基酸发生了突变,由赖氨酸变成蛋氨酸。