水稻矮缩病毒昆明分离物抗血清制备及免疫捕捉PCR检测

由水稻矮缩病毒(Rice dwarf viru S,RDV)引起的水稻矮缩病害,最早由日本报道,随后在东南亚等国以及我国的福建、云南等南方稻区普遍发生,云南主要发生于中部及南部地区[1].水稻在苗期至分蘖期感病后,植株矮缩,分蘖增多,叶片浓绿,僵直,出现白斑,生长后期病稻不能抽穗结实,在暴发流行年份可以引起水稻的严重减产.     

水稻矮缩病毒非结构蛋白基因S6的表达和抗血清的制备

经RT-PCR扩增出水稻矮缩病毒（RDV）中国分离物非结构蛋白基因S6,并克隆至pGEM-Teasy载体上,序列分析表明该基因与日本株具有高度同源性,并且含有较高比例的稀有密码子。将S6基因克隆到表达载体pGEX-6P-1,并转化大肠杆菌,该基因在大肠杆菌以包涵体形式大量表达,以表达的融合蛋白作抗原免疫家兔,制备抗S6蛋白的抗血清,ELISA测定表明,该血清与抗原共价特异性反应,抗血清的效价为1：3000.Western blot印迹实验表明该抗血清能特异性检测RDV感染的水稻组织中的S6蛋白,因而可作为感染RDV的水稻植株的分子手段。     

水稻矮缩病毒非结构蛋白基因S6的表达和抗血清的制备

经RT-PCR扩增出水稻矮缩病毒(RDV)中国分离物非结构蛋白基因S6,并克隆至 pGEM-Teasy 载体上.序列分析表明该基因与日本株具有高度同源性,并且含有较高比例的稀有密码子.将S6基因克隆到表达载体pGEX-6P-1,并转化大肠杆菌,该基因在大肠杆菌以包涵体形式大量表达.以表达的融合蛋白作抗原免疫家兔,制备抗S6蛋白的抗血清,ELISA 测定表明,该血清与抗原共价特异性反应,抗血清的效价为13000. Western blot印迹实验表明该抗血清能特异性检测RDV感染的水稻组织中的S6蛋白,因而可作为感染RDV的水稻植株的分子手段.     

水稻齿叶矮缩病毒Pns10蛋白的原核表达、抗血清制备及初步应用

水稻齿叶矮缩病毒Pns10蛋白由基因组片段S10编码。从RRSV福建沙县分离物(RRSV-F)中获取该病毒的全基因组,根据RRSV泰国分离物核苷酸序列设计特异性引物获得S10编码区,利用Directional TOPO克隆技术,将S10连接至克隆表达载体pET100/D-TOPO构建重组质粒,并进行了序列测定和分析。重组质粒经IPTG诱导在BL21star(DE3)E.coli中高效表达约35 kD Pns10蛋白。将Pns10蛋白免疫新西兰大白兔制备了特异性的抗血清,间接ELISA法测定抗血清效价为1∶7 680,Western blot分析表明抗血清特异性强。表达产物及抗血清在Pns10蛋白的结构和功能研究中具有重要的应用价值,制备的抗血清可用于水稻病株和传播介体的检测以及病毒病的诊断。     

水稻矮缩病病毒粒子装配模型

水稻矮缩病病毒(RDV)具有多种蛋白质和RNA构成的核衣壳结构, 但是特异性的RNA与蛋白质、蛋白质与蛋白质之间的相互作用和结合, 即有关病毒粒子的装配机理还没有完全阐明. 从细胞内和细胞外两个研究层次详细研究了RNA与蛋白质相互结合情况, 研究发现, P7蛋白能特异并牢固地与RDV基因组的全部12条双链RNA结合; 推定为RNA聚合酶的P1蛋白、鸟苷酰转移酶的P5蛋白和P7蛋白被包裹在病毒核内, 根据体外结合实验, 它们能与病毒转录产物mRNA结合; 从病毒感染的组织中能够提取得到完整的、有感染活性的病毒粒子, 以及缺失P1, P5, P7蛋白和基因组双链RNA, 没有感染活性的空壳病毒粒子; 在病毒粒子中P7蛋白能够与P1蛋白和P3内衣壳蛋白形成蛋白复合物. 这些结果揭示了RDV病毒粒子装配的一种可能的模型, 即核心蛋白和病毒mRNA首先相互结合形成一个整体, 以筛选和富集病毒RNA, 接着包装成为完整的、具有感染活性的病毒粒子.     

南方水稻黑条矮缩病毒快速检测

南方水稻黑条矮缩病毒(southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)引起的新水稻矮缩病近年在越南北部和我国南方各省爆发,准确快速地检测病毒是病害预测的关键。本文针对该病毒的S10序列设计了一对新的引物S10F/S10R,利用一步法RT-PCR,对2010年5~8月间湖南省下属各县送来的疑似感染该病毒引起的水稻矮缩病样本进行了检测,结果显示,新引物能有效地区分阳性样品和非阳性样品。同时对PCR产物进行了序列测定,结果表明序列均与已发表的南方水稻黑条矮缩病毒序列(登录号:EU523360和EU784840)达约99%的同源性。还在此基础上构建了系统发育树,发现SRBSDV湖南、广东和海南分离物病毒位于一个相对独立的分支。研究发现相对以往的巢式RT-PCR,本文采用的新引物及一步法RT-PCR能快速检测南方水稻黑条矮缩病毒,简化了操作步骤,缩短了检测时间,适合在SRBSDV检测和病害预测中应用。     

水稻矮缩病毒基因组数据库的构建

二级数据库的构建是生物信息学新的重要领域。目前部分生物的基因组序列测定完成后,正在进行广泛而深入的结构和功能研究,使二级数据库的重要性显得日益突出。水稻矮缩病毒是一种在日本、中国和东南亚感染水稻的病原微生物,给农业生产造成很大损失。根据国际和国内对水稻矮缩病毒基因组的研究,利用已有的基因序列和结构、功能等方面的数据,以计算机网络为载体,参考国际通用数据库的格式,尝试建立一个简洁的、友好的通用性好而且专用性强的二级数据库：水稻矮缩病毒基因组数据库。希望能够为研究普通水稻矮缩病毒的粒子结构、基因表达调控、致病机理和防治方法提供一个良好的工具,为从事水稻矮缩病理论和应用研究的工作者提供方便和帮助,并为探索二级数据库的构建积累经验。     

浙江和河北发生的一种水稻、小麦、玉米矮缩病是水稻黑条矮缩病毒引起的

以浙江省的水稻黑条矮缩病和河北省的玉米粗缩病的病毒分离物为材料,对我国南北方两种病毒分离物进行了比较研究。两种病毒分离物的粒子大小形态相似,且在血清学上密切相关;二者的介体、寄主相同,并引起相同的症状,提纯两种病毒分离物的基因组片段凝胶电泳显示它们相应的基因组片段之间大小极相似。根据水稻黑条矮缩病毒（Rice black strecaked dwarf virus),RBSDV的S7和S8设计引物,利用PR－PCR技术,在两种病毒分离物中均可特异扩增到预期大小的片段,序列测定比较分析表明：它们的同源性达97．0％－98．9％,与日本RBSDV的同源性（92．2％－95．5％）高于与意大利MRDV的同源性（76．6％－88．4％）。从而认为我国南方的水稻黑条矮缩病和北方和玉米粗缩病都是同一种病毒－RBSDV引起的,也就是说我国北方的玉米粗缩病病原实际上是水稻黑条矮缩病毒,而不玉米粗缩病毒。     

利用转hpRNA基因水稻抗水稻矮缩病毒

具有发夹结构的双链RNA(hairpin RNA,hpRNA)能高效诱导转录后基因沉默的发生.以水稻(Oryza sativaL.)矮缩病毒(RDV)基因组中第八片段编码区128～754 bp的序列为臂构建hpRNA,并克隆到植物表达载体pROK-2上.通过农杆菌介导的方法转化水稻\"中花11\".Southern blot分析表明,共获得12株阳性转化体.用带有RDV的叶蝉(Nephotettix cincticeps)接种Tl代转hpRNA水稻,结果表明转基因水稻对RDV具有高抗性或表现为症状延迟.而相同序列的有义链的转基因水稻和空载体的转基因水稻表现为典型的RDV侵染症状.HpRNA在转基因水稻中对RDV高抗性发挥重要作用.     

水稻矮缩病毒基因组第六号片段编码区的cDNA克隆及序列分析

从水稻矮缩病毒中国福建分离物的基因组中分离出第六号片段的双链ＲＮＡ,根据已发表的日本分离物第六号片段ｃＤＮＡ全序列合成了两个寡聚核苷酸引物,经过逆转录合成ｃＤＮＡ,应用ＰＣＲ方法扩增了编码区的基因序列,并将扩增产物克隆到ｐＧＥＭ３Ｚｆ（－）载体上。对重组子进行限制性酶切分析和ＤＮＡ序列分析证明,得到的是ＲＤＶ第六号片段完整的编码序列,进而构建了亚克隆并进行了全序列测定。结果表明,我们所扩增和克隆的     

大蒜病毒检测用抗血清制备的研究

本文报告了从阿城大蒜田间感染病叶片中分离了大蒜病毒,用聚乙二醇沉淀法提取的抗原浓度高于差速离心法.制备的抗血清效价达1024以上.电镜观察粗提纯的病毒粒子,呈线状,长度为516～846nm占46.9%,1142～1525nm占40.6%.     

水稻普通矮缩病研究进展

水稻普通矮缩病（又称普矮病）,是由叶蝉传播的一类病毒性病害,近年来有扩散的趋势。该病在水稻上的发病症状表现为感病植株矮小、无效分蘖增多、根系发育不良、叶片僵直、不能抽穗,造成水稻减产和绝收,给粮食生产安全带来巨大威胁。主要就病原及其介体、病毒检测方法、基因工程及RNA干扰技术培育抗病性种质及品种筛选等方面对近年来水稻普通矮缩病相关研究进展进行阐述,为该病的深入研究特别是基因工程育种提供参考。     

抗水稻矮缩病毒的反义核酶及复制酶部分序列的合成、克隆及其水稻表达载体的构建

采用反转录－聚合酶链式反应方法（ＲＴＰ－ＣＲ）,在人工合成的引物引导下,扩增出水稻矮缩病毒基因组第一片段（Ｓ１）全长序列及第五片段的部分序列（ＳＳⅢ）．将扩增的片段分别克隆到克隆载体ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）及ｐＵＣ１９的ｓｍａｌ位点上,并进行了序列测定。在此基础上,利用ｐＣＲ引入的方法将核酶序列引入到Ｓ５Ⅲ片段反义链上以构成反义核酶基因Ｓ５ⅢＲ,将Ｓ１片段５＇端部分序列（Ｓ１－１）及Ｓ５ⅢＲ基因克隆到植物表达载体ｐＲＯＫⅡ上,构建成水稻转化载体ｐＲＯＫ－Ｓ１－１＇及ｐＲＯＫ－Ｓ５ⅢＲ。     

水稻南方黑条矮缩病毒湖南鼎城株系S10片段的基因组序列分析

运用RT-PCR技术克隆了水稻南方黑条矮缩病毒(southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)湖南鼎城株系的基因组S10片段(SRBSDV-HuNDCS10),并对其全序列进行了测定和生物信息学分析。结果显示,SRBSDV-HuNDC S10片段全长为1797bp(登录号:JQ337964),含有1个ORF,编码557个氨基酸残基的衣壳蛋白,推测分子量约62.6kD,推测等电点为7.62,与已报道的广东、海南和云南分离物病毒的S10作比较,它们的核苷酸相似性分别为99.7%、99.0%和98.4%,氨基酸相似性分别为100.0%、99.5%和99.3%。对SRBSDV-HuNDCS10及部分Fijiviruses病毒对应片段在5’URT与3’URT存在的保守序列和互补序列进行了归纳,对其ORF编码的氨基酸序列进行了motif查找,得到该属(Fijiviruses)氨基酸序列的10个保守区段。此外,进行了糖基化位点、磷酸化位点及B细胞抗原表位预测,发现了3个可能的N端豆蔻酰基化位点,可能与病毒的侵染机制有关。     

Expression of Rice Gall Dwarf Virus Outer Coat Protein Gene (S8) in Insect Cells

To obtain the P8 protein of Rice gall dwarf virus (RGDV) with biological activity,its outer coat protein gene S8 was expressed in Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells using the baculovirus expression system.The S8 gene was subcloned into the pFastBacTM1 vector,to produce the recombinant baculovirus transfer vector pFB-S8.After transformation,pFB-S8 was introduced into the competent cells (E.coli DH10Bac) containing a shuttle vector,Bacmid,generating the recombinant bacmid rbpFB-S8.After being infected b...     

紫藤脉花叶病毒cp基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

采用RT-PCR方法自紫藤脉花叶病毒北京分离物(WVMV-BJ)的基因组中分离出其CP基因,连接到原核表达载体pET22b(+)上.获得的重组子pET-WVMVCP转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE和Western blot分析表明,cp基因在大肠杆菌中获得了高效表达,融合蛋白分子量约为34.4 kDa.将融合蛋白纯化后免疫兔子,获得了特异性较高的抗血清.微量免疫沉淀法测定该抗血清的效价为1/1024,酶联法(enzyme-linkedimmunosorbant assay,ELISA)测定的效价为1/8192.     

Sequence Analysis of Segment 8 of Five Chinese Isolates of Rice Gall Dwarf Virus and Expression of a Main Outer Capsid Protein in Escherichia coli

The rice gall dwarf disease, caused by the Rice gall dwarf virus (RGDV) is a serious disease occurring in rice in many regions of Guangdong province. As a basis to control the disease we have studied the genomic diversity of a variety of isolates from different locations. Genome segment 8(S8), encoding a main outer capsid protein (Pns8) of RGDV five isolates (BL, CH, DQ, GZ, XY) from Guangdong province was cloned and sequenced. The results revealed that all the S8 segments of the five isolates consisted of 1 578 nucleotides and had a single open reading frame (ORF) extending for 1 301 nucleotides from nucleotide 21 which encoded a polypeptide of 426 amino acids with an estimated molecular weight of 47.4 kDa. The S8 full-length sequence and the ORF sequence shared 97.3%-98.8% and 97.3%-99.1% nucleotide sequence identities within the five Chinese isolates, and shared 94.8%-95.6% and 95.0%-96.0% identities with those of the Thailand isolate respectively. The deduced amino acid sequence of Pns8 in GZ isolate was identical to that in the Thailand isolate, while the amino acid sequence variability of Pns8 within five Chinese isolates ranged from 0.5% to 2.1%. These results indicate that the S8 segment of RGDV is highly conserved in different isolates from different locations. The S8 cDNA from the XY isolate was cloned into the plasmid vector pET-28b(+) and a fused expression protein with an apparent molecular mass of 51kDa was specifically detected in an analysis of Escherichia coli Rossetta(DE3)Ⅱcells. To our knowledge, this is the first report on analysis of the RGDV segment 8 sequence and genetic comparison of different RGDV isolates and their protein expression.     

Sequence Analysis of Segment 8 of Five Chinese Isolates of Rice Gall Dwarf Virus and Expression of a Main Outer Capsid Protein in Escherichia coli

The rice gall dwarf disease, caused by the Rice gall dwarf virus (RGDV) is a serious disease occurring in rice in many regions of Guangdong province. As a basis to control the disease we have studied the genomic diversity of a variety of isolates from different locations. Genome segment 8(S8), encoding a main outer capsid protein (Pns8) of RGDV five isolates (BL, CH, DQ, GZ, XY) from Guangdong province was cloned and sequenced. The results revealed that all the S8 segments of the five isolates consisted of 1 578 nucleotides and had a single open reading frame (ORF) extending for 1 301 nucleotides from nucleotide 21 which encoded a polypeptide of 426 amino acids with an estimated molecular weight of 47.4 kDa. The S8 full-length sequence and the ORF sequence shared 97.3%-98.8% and 97.3%-99.1% nucleotide sequence identities within the five Chinese isolates, and shared 94.8%-95.6% and 95.0%-96.0% identities with those of the Thailand isolate respectively. The deduced amino acid sequence of Pns8 in GZ isolate was identical to that in the Thailand isolate, while the amino acid sequence variability of Pns8 within five Chinese isolates ranged from 0.5% to 2.1%. These results indicate that the S8 segment of RGDV is highly conserved in different isolates from different locations. The S8 cDNA from the XY isolate was cloned into the plasmid vector pET-28b( ) and a fused expression protein with an apparent molecular mass of 51kDa was specifically detected in an analysis of Escherichia coli Rossetta(DE3)Ⅱcells. To our knowledge, this is the first report on analysis of the RGDV segment 8 sequence and genetic comparison of different RGDV isolates and their protein expression.