产己酸细菌的研究Ⅳ．产己酸细菌与产甲烷菌的混合培养

将克氏梭菌和嗜树木甲烷短杆菌混合培养,同时用溴代磺酸乙烷抑制甲烷的产生作为对照,发现己酸产量基本相同,加入产甲烷菌并未使克氏梭菌的己酸产量有所增加。     

克氏梭菌硫解酶的鉴定及其功能研究

【目的】硫解酶是梭菌属微生物合成短中链脂肪酸的关键酶。克氏梭菌(Clostridium kluyveri)具有3个高度同源的硫解酶编码基因,对这3个基因的功能鉴定是解析克氏梭菌高己酸合成能力的关键。【方法】通过发酵动力学分析确定克氏梭菌的己酸和丁酸生成动力学特征;转录组测序结合反转录-荧光定量RCR分析克氏梭菌3个硫解酶编码基因的表达水平和时序表达特征;在大肠杆菌中异源表达这3个硫解酶,并对其硫解酶动力学参数进行测定。【结果】克氏梭菌生成丁酸、己酸、辛酸,其中己酸为主要代谢产物;转录组数据显示,在乙酸消耗完全之前,thlA1基因维持恒定表达,thlA2基因表达时序上调,thlA3基因表达时序下调,转录组测序表明3个硫解酶编码基因均具有较高水平的转录活性,thlA2和thlA3的最高表达量分别约为thlA1的29%和43%;硫解酶动力学参数测定结果表明,克氏梭菌3个硫解酶对于四碳底物均显示出相似的底物亲和力(K_m),但ThlA1对四碳底物的催化效率(k_(cat)/K_m)略低于ThlA2和ThlA3。【结论】克氏梭菌的3个硫解酶均具有催化活性,在克氏梭菌体内均呈活跃表达,表明克氏梭菌拥有3个具有催化活性的硫解酶,这为后续深入研究克氏梭菌己酸合成机理奠定了基础。     

果蔬废弃物两相厌氧发酵产己酸的效能研究

利用厌氧菌群生物合成己酸被认为是一种非常有潜力的新型废弃物资源化技术,但是其合成效能的提高是目前亟待解决的关键问题。本研究以实际果蔬废弃物为原料,对两相厌氧发酵产己酸的效能进行了研究。首先优化接种比以提高酸化相的水解转化效率;在此基础上通过调控醇酸比和pH以强化产己酸相的发酵效能。结果显示,果蔬废弃物厌氧产酸的最佳接种比为2∶1,此时水解率和酸化率分别可达到98.1%和83.2%,乙酸和丁酸产量分别达到5.4 g/L和3.3 g/L。合理控制醇酸比和pH对提高产己酸相的发酵效能非常关键。当醇酸比和pH控制为4∶1和7.5时,己酸生成量可达14.9 g/L,约占液相总COD的80.84%;而低醇酸比和低pH易造成丁酸的累积,从而降低了己酸产量。己酸发酵过程属于非生长偶联型,己酸菌(Clostridium kluyveri)指数增长期伴随着丁酸的生成,而己酸合成主要发生在生长中后期。此外,己酸菌对于pH变化较为敏感,适当提高pH有助于减轻有机酸毒性,提高生物量;但是碱性环境会严重抑制己酸菌的生长繁殖。研究表明,通过分别对酸化相和产己酸相进行优化和调控,两相发酵策略更有利于提高己酸合成效能。     

洋河酒窖泥细菌群落结构与菌株产酸能力分析

【背景】窖泥微生物的种类及其代谢产物类型是影响浓香型白酒发酵过程中丁酸和己酸等白酒中主要有机酸合成的影响因素之一。【目的】揭示浓香型白酒不同窖龄窖泥细菌群落结构,研究厌氧细菌产酸性能,阐明窖泥细菌与白酒中有机酸合成的相关性。【方法】通过Illumina HiSeq高通量测序,基于16S rRNA基因序列分析不同窖龄窖泥细菌的组成。分离获得厌氧细菌,通过比较菌株产丁酸和己酸能力来分析窖泥的微生物代谢特性。【结果】洋河酒窖泥细菌主要分布于梭菌纲(Clostridia)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、互营养菌纲(Synergistia)和芽孢杆菌纲(Bacilli)。20年窖龄的窖泥中氢孢菌属(Hydrogenispora)和瘤胃梭菌属(Ruminiclostridium)丰度显著增加。窖泥细菌间相关性分析表明,瘤胃梭菌属(Ruminiclostridium)为窖泥中影响最大的核心微生物,很多微生物与梭菌属(Clostridium)菌株之间多为相互促进关系。通过传统可培养方法共分离得到梭菌目(Clostridiales)的20株厌氧菌。其中梭菌属(Clostridium)菌株产酸能力高于其他菌属,酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)产丁酸和己酸的能力最强。产丁酸能力最高的菌主要分离自5年和20年窖龄窖泥,产己酸能力最高的菌分离自20年窖龄窖泥。【结论】解析了浓香型白酒不同窖龄窖泥的细菌组成,并对菌株产丁酸和己酸的能力进行了比较,为揭示窖泥微生物功能及其对白酒风味物质合成的影响奠定了相关的研究基础。     

己酸菌LⅡ己酸发酵过程中生理及代谢特点

在了解了产己酸细菌ＬＩＩ的发酵最适条件的基础上,进一步对己酸发酵过程中的生理及代谢特性作了较详细的分析。结果表明,在己酸发酵过程中除产生正常代谢产物己酸外,还产生丁酸、乙酸、戊酸等其它酸类和甲烷,氢气和ＣＯ_２等气体。用１—^１３Ｃ－乙酸钠和未标记的乙醇作为底物发酵,用色质联用仪（ＧＣ／ＭＳ）分析,结果表明：在己酸合成中碳的来源为乙醇和乙酸,中间代谢产物为丁酸。     

用固定化细胞发酵生产己酸的研究

固定于海藻酸钙、琼脂、卡拉胶、聚丙烯酰胺凝胶,魔芋葡苷露聚糖等几种载体上的己酸菌株(Doseridium sp．WI)批次发酵表明,海藻酸钙包埋己酸菌活性最高。在最适条件下,己酸产量最高可达15mg／ml,经18批次(200余天)的批式发酵,固定化己酸菌产己酸活性稳定性较好,4℃储存二月后的固定化细胞,其发酵产己酸活性与储前基本相同。短暂的与空气接触对固定化己酸菌的活性几乎没受影响。与游离已酸菌比较,固定化细胞的己酸生成速度加快,己酸产量明显提高,单位体积内的细胞数目可高出游离培养的近10倍。     

己酸菌和产酯酵母共固定产己酸乙酯的研究

用吸附包埋法将己酸菌和产酯酵母共固定在海藻酸钙棉纤维上,在帘式生物反应器中进行分批式发酵。最适ｐＨ为６.５,温度３０～３５℃。经过共固定１０批发酵,历时１００ｄ,凝胶的稳定性良好,己酸乙酯产量也稳定在１.９～２.３ｍｇ／ｍｌ之间,经对比试验证明,用共固定法合成己酸乙酯比游离细胞混菌发酵法产量提高约２２％。     

己酸菌的分离筛选及发酵条件的研究

己酸菌所生成的己酸是生产浓香型白酒主体香气己酸乙酯的主要成分,将其应用于白酒的生产,可提高白酒的香气和质量．从我省富裕酒厂的窖泥中分离到一株高产己酸的菌株,通过发酵条件的研究,该菌株己酸最高产量可达540mg／100ml。     

乙醇对瘤胃细菌发酵纤维类饲料产短链脂肪酸能力的影响

【背景】瘤胃细菌发酵碳水化合物产生的短链脂肪酸(Short Chain Fatty Acid,SCFA),可作为燃料和化工产品的前体物。乙醇在碳链延伸产生己酸过程中具有重要作用,但对瘤胃发酵不同纤维类饲料产己酸能力的研究少有报道。【目的】揭示乙醇对纤维类饲料体外瘤胃发酵的SCFA产量差异,挖掘潜在的产C5和C6脂肪酸细菌。【方法】利用体外连续传代和Illumina HiSeq测序等技术,比较了添加乙醇对6种饲料产SCFA能力的影响以及细菌群落结构的差异。【结果】6种纤维类饲料的总SCFA产量顺序为黑麦草>小黑麦草>燕麦草>玉米芯>稻秸>甜叶菊。添加乙醇显著提高了小黑麦草、黑麦草的戊酸和己酸产量;细菌群落以厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为优势菌门,乙醇显著提高了燕麦草组和小黑麦草组的放线菌门(Actinobacteria)和软壁菌门(Tenericutes)相对丰度;种水平上,甜叶菊、稻秸和玉米芯的优势菌与燕麦草、小黑麦草和黑麦草的优势菌相对丰度不同。相对丰度前10的细菌中,Prevotella sp.DJF CP65、Clostridium butyricum和Bifidobacterium thermophilum相对丰度与戊酸产量呈显著正相关,C.butyricum相对丰度与己酸产量呈显著正相关。【结论】瘤胃细菌体外发酵纤维类饲料并添加乙醇可生产更多戊酸和己酸,该结果为筛选可培养瘤胃细菌用于体外发酵提高戊酸和己酸产量、挖掘瘤胃细菌功能提供了参考数据。     

沼气池中产氢细菌的研究

1. 在沼气发酵污泥的富集培养物中加入薯芋粉可以旺盛地产氢。这是富集培养沼气发酵污泥中的产氢细菌的较好方法。 2. 我们采用这一方法从沼气池中分离出24株产氢细菌,其产氢置因菌株的种类和发酵基质的不同而异。根据它们的分类特征分别属肠杆菌科(Enterbacteriace)和芽孢杆菌科(Bacil-laceae)。肠杆菌科中有五个种：阴沟肠杆菌(Entcrbacter cloacae),大肠埃希氏菌(Escheriehiacoli),粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens),弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)和蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)(暂定)。芽孢杆菌科中仅有一个种,即丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutyltcum)。 3. 各类菌的相对数量以肠秆菌占优势,占总数的58.3％。其次是粘质沙雷氏菌,占16.7％。丙酮丁酵梭菌占12．5％。其他各菌数量较少。 4. 将这些产氢菌与甲烷菌的富集培养物进行混合培养,可大大提高甲烷产量,而二氧化碳显著降低,以至检测不到。