首页 | 本学科首页   官方微博 | 高级检索  
   检索      
共有20条相似文献,以下是第1-20项 搜索用时 265 毫秒

1.  莱氏野村菌Cq菌株几丁质酶基因的克隆与表达分析  被引次数:2
   王金芳  刘光英  翟逸  万永继《微生物学报》,2010年第50卷第4期
   摘要:【目的】为揭示昆虫病原真菌分泌的几丁质酶对宿主感染致病时的作用,对莱氏野村菌Cq菌株几丁质酶基因进行了克隆与表达,并检测了表达产物的活性。【方法】采用CTAB法提取菌体DNA,设计特异性引物,多次PCR扩增克隆莱氏野村菌Cq菌株几丁质酶基因全序列,并克隆基因的ORF片段chit1,与载体pPIC9K相连接,构建表达载体pPIC9K-Chit1,转入毕赤酵母感受态细胞中,然后通过1.5 mg/L浓度的G418筛选及PCR验证,将阳性转化子进行诱导培养,对发酵液分别进行酶活性测定试验、几丁质酶透明圈验证    

2.  膜荚黄芪种子中2种几丁质酶的分离纯化及活性测定  被引次数:1
   费凡  闫巧娟  江正强  Kumar Narasimha《西北植物学报》,2009年第29卷第12期
   运用传统的层析技术对膜荚黄芪种子中两种几丁质酶进行分离纯化,并对分离纯化中各个步骤得到的蛋白进行了活性研究.结果表明:(1)粗提液的硫酸铵沉淀经再生几丁质亲和柱和凝胶过滤层析Sephadex G-75得到几丁质酶A.(2)粗提液的硫酸铵沉淀经离子交换色谱DE-52、CM、凝胶过滤层析Sephadex G-75得到几丁质酶B.(3)几丁质酶A、B的比活性分别为35.6 U/mg和4.1 U/mg.(4)从膜荚黄芪种子中分离纯化的几丁质酶A和B均为糖蛋白,含糖量分别为6.1%和5.8%.(5) SDS-PAGE显示,几丁质酶A、B的分子量分别为35.5 ku、39.6 ku;凝胶过滤层析测定几丁质酶A、B的分子量分别为36.9 ku、40.8 ku;表明几丁质酶A、B均为单亚基蛋白.    

3.  转几丁质酶基因防植物病害研究:进展、问题与展望  被引次数:2
   高必达《中国生物工程杂志》,1999年第19卷第2期
   综合评述了近几年转几丁质酶基因防植物病害研究中的发现与进展:(1)至少31种病原真菌(含变种和专化型)可诱导植物几丁质酶,(2)据称已提纯的植物几丁质酶对立枯丝核菌等真菌呈现了体外抑菌活性;(3)一些生防细菌的防病作用依赖于其几丁质酶基因的存在;(4)数种植物几丁质酶基因和一种细菌几丁质酶基因已被转入水稻、烟草、番茄等植物,一些转基因株系抗病性显著增强;(5)粘质沙雷氏菌的一种几丁质酶基因已被转入荧光假单胞菌和根瘤菌中,转基因细菌对立枯丝核菌有显著抑制作用。就几丁质酶抑菌谱、转基因的策略和研究中存在的疑点进行了分析讨论。建议今后的研究方向应集中在以下几方面:(1)加速转几丁质酶基因或几丁质酶基因与其它基因组合的植物实用化;(2)进一步研究不同基因组合的增效作用及增效机理;(3)查明个别几丁质酶基因的抑菌谱及选择性抑菌机制;(4)转几丁质酶基因或与其它基因的组合于植物内生细菌。    

4.  HaSNPV几丁质酶基因在大肠杆菌和昆虫细胞中的表达及其产物对Bt杀虫剂的增效作用  被引次数:4
   王芳  顾奇伟  武家才  张传溪《中国生物化学与分子生物学报》,2004年第20卷第6期
    为了探索杆状病毒几丁质酶对微生物杀虫剂的增效作用及其利用途径 ,分别在大肠杆菌和昆虫细胞中表达棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒 (HaSNPV)几丁质酶 .用PCR方法扩增出不含N端信号肽编码序列的几丁质酶基因片段 ,并分别克隆至原核表达载体pET2 8a和重组到杆状病毒BactoBac表达系统 ,在大肠杆菌 (E .coli)BL2 1和粉纹夜蛾 (Trichoplusiani)细胞系Tn 5B1 4中分别进行了表达 .在大肠杆菌中表达量约占细菌总蛋白 15 % ,在昆虫细胞中表达量约占细胞总蛋白10 % .将含有几丁质酶的大肠杆菌和昆虫细胞表达产物添加到苏云金杆菌 (Bt)菌液中一起喂食 2龄家蚕 .结果显示 ,HaSNPV几丁质酶基因的 2种表达产物和Bt杀虫剂的混合物使处理的家蚕的致死时间较对照处理均明显缩短 .昆虫细胞和大肠杆菌表达产物与Bt混合物处理的LT50 分别从 93 5h和 95 1h缩短到 5 6 2h及 6 7 2h ,并且供试家蚕的生长速度明显缓慢 .研究结果表明 ,重组的HaSNPV几丁质酶有望作为Bt杀虫剂的增效剂    

5.  重组毕赤酵母表达棘孢木霉几丁质酶Tachi1的酶学性质研究及表达条件优化  
   汤伟  李雅华  刘露  张军霞  咸洪泉《微生物学报》,2012年第52卷第3期
   【目的】对转棘孢木霉几丁质酶基因tachi1的毕赤酵母工程菌GS-tachi1-K进行诱导表达,研究重组几丁质酶Tachi1的酶学性质,优化表达条件。【方法】对GS-tachi1-K进行甲醇诱导培养,纯化目的蛋白Tachi1进行几丁质酶酶学性质的研究;通过单因素和正交试验对GS-tachi1-K菌株产几丁质酶Tachi1表达条件进行优化。【结果】GS-tachi1-K表达的几丁质酶Tachi1表观分子量约为44 kDa,酶反应最适的温度和pH分别为50℃和5.5,具有较宽的温度、pH适用范围;50℃以下保持较高的酶活力,在碱性条件下稳定性较差;受Ag+、Hg2+、Cu2+、Fe2+和高浓度的SDS及β-巯基乙醇强烈抑制。该菌株的最佳表达条件为:pH为6.5,甲醇诱导浓度为0.5%,起始细胞浓度为OD600=2,甲醇诱导时间为180 h;几丁质酶Tachi1活力可达17.93 U/mL,蛋白表达量为6.19 g/L。【结论】成功实现了棘孢木霉新几丁质酶基因tachi1的毕赤酵母高效分泌表达,工程菌GS-tachi1-K具有高表达量和表达产物酶活性高两个特点,明确了几丁质酶Tachi1的酶学性质和最佳诱导表达条件,为该几丁质酶及其基因的深入研究和开发利用奠定了基础。    

6.  一株拮抗香蕉枯萎病的内生细菌的分离及其几丁质酶基因信号肽的分泌活性分析  被引次数:2
   夏启玉  王宇光  孙建波  卢雪花  顾文亮《中国生物工程杂志》,2010年第30卷第9期
   目的:旨在分离并选择一株香蕉内生细菌作为内生基因工程生防菌,并克隆其几丁质酶基因的信号肽序列。方法:从香蕉植株杆下部分离并选择了一株拮抗香蕉枯萎病且具有分泌几丁质酶能力的内生细菌,对该菌株进行了形态观察、生理生化测定和16S rDNA序列分析,克隆了其几丁质酶基因的编码序列并预测了其信号肽,构建了含有信号肽和不含信号肽的几丁质酶的表达菌株BL-chi1和BL-chi2。结果:结合形态观察、生理生化特征和16S rDNA序列比对分析确定该菌株为Klebsiella属,将该菌株命名为KKWB 5;BL-chi1和BL-chi2经IPTG诱导后,均表达了与预期蛋白大小一致的蛋白,同时BL-chi1诱导后的培养基上清中出现一条约45kDa的条带,而BL-chi2和空载体的BL-pET22b诱导后的培养基上清中均无此条带;几丁质水解试验发现,BL-chi1诱导后的培养基上清中的蛋白经浓缩和纯化后都能在几丁质平板上形成透明水解圈。结论:该几丁质酶的信号肽能被BL21(DE3)所识别,将几丁质酶分泌到培养基中,并且分泌的几丁质酶具有水解几丁质的生物学活性。内生菌KKWB-5的分离及其几丁质酶分泌信号肽序列的克隆为进一步构建内生工程菌来防治香蕉枯萎病打下了基础。    

7.  几丁质酶及其在抗植物真菌病害中的作用  被引次数:11
   马汇泉  甄惠丽  孙伟萍《微生物学杂志》,2004年第24卷第3期
   几丁质酶 (ChitinaseEc .3.2 .1 4 )广泛存在于植物、动物及微生物细胞和组织中 ,参与多种生理过程。几丁质是构成大多数真菌细胞壁的主要成分。研究发现许多微生物都可以产生几丁质酶。几丁质酶的生物活性可显著抵抗植物真菌病害。对几丁质酶的研究历史和现状进行了综合论述 ,并对几丁质酶及其抗病性、几丁质酶在植物病害生物防治和抗病基因工程中的应用前景进行了展望。    

8.  苏云金杆菌以色列亚种几丁质酶基因的克隆及序列分析  
   钟万芳  姜丽华  阎文昭  蔡平钟  张志雄  裴炎《遗传学报》,2003年第30卷第4期
   从苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp israelensis)中提取基因组DNA,通过合成1对特异性引物,用touchdown PCR的方法扩增几丁质酶ichi基因序列(GenBank登录号:AF526379)。ichi序列全长为2570bp,含有1个2067bp的开放阅读框(ORF),编码688个氨基酸,推测分子量为75.79kDa,等电点pI=5.90的几丁质酶前体。序列和结构比较分析表明:Ichi氨基酸序列与蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)28-9几丁质酶CW、蜡状芽孢杆菌CH几丁质酶B及苏云金芽孢杆菌墨西哥亚种几丁质酶的同源性分别为97.24%、97.18%、97.63%,而与苏云金芽孢杆菌巴基斯坦亚种的同源性只有63.07%。Ichi编码区由分泌信号肽(46AA)、催化区(105AA)、粘蛋白Ⅲ型同源区(74AA)及几丁质结合区(40AA)组成。    

9.  环状芽孢杆菌几丁质酶基因序列分析、表达和生物活性测定  被引次数:3
   王焰玲 王海燕 秦敏 张义正《微生物学报》,2002年第42卷第5期
   真菌病害一直是影响作物的主要病害之一 ,每年造成巨大经济损失。几丁质酶可水解许多病原真菌细胞壁所含有的主要成分—几丁质 ,是研究得最多的抗真菌蛋白质。许多几丁质酶基因已从微生物中克隆到 ,芽孢杆菌是一类重要的几丁质酶产生菌。环状芽孢杆菌可产生并分泌多种多糖降解酶类 ,包括几丁质酶、β 1 ,3 葡聚糖酶、β 1 ,6葡聚糖酶和半纤维素酶[1] 。Watanabe克隆了环状芽孢杆菌WL 1 2菌株的几丁质酶基因chiA和chiD ,对该几丁质酶基因的结构和功能进行了深入研究[2~ 4 ] 。我国的陈三凤克隆了黄杆菌的几丁质酶基因 ,…    

10.  棘孢木霉(Trichoderma asperellum)几丁质酶基因的克隆与生物信息学分析  被引次数:2
   汤伟  夏伟  李雅华  丛大鹏  咸洪泉《中国生物化学与分子生物学报》,2012年第4期
   几丁质酶作为木霉菌防治植物病虫害的主要因子,在生物防治和环境保护等领域发挥着重要的作用.为了研究棘孢木霉(Trichoderma asperellum)的生防机制并获得与其相关的功能基因,本研究通过RT-PCR、3’-RACE及5’-TAIL-PCR技术克隆了T.asperellum 1个几丁质酶基因Tachi1,对该基因进行了生物信息学分析,并利用毕赤酵母表达系统进行表达验证.Tachi1的DNA序列长1 635 bp,含有3个内含子,包含1 275 bp的开放阅读框,编码424个氨基酸;Tachi1属于糖基水解酶18家族内切几丁质酶,包含SIGGW底物结合位点和FDGIDXDWE活性中心位点,信号肽长度为22个氨基酸,成熟肽分子量为44 kD,二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲为结构元件,三级结构为(α/β)8的圆桶形结构.转Tachi1基因酵母工程菌可高效分泌表达几丁质酶Tachi1,甲醇诱导培养8 d几丁质酶酶活可达9.25 U/mL.    

11.  几丁质酶基因的克隆表达及酶学性质  
   郑家敏  梁燕辉  朱凡  叶秀云  林娟《微生物学通报》,2018年第5期
   【背景】几丁质是自然界中储藏量仅次于纤维素的有机物,几丁质酶能降解几丁质生成几丁寡糖,实现废弃物的高值化利用,目前菌株产几丁质酶能力低限制了它的生产应用。【目的】克隆弧菌(Vibrio sp.)GR52的几丁质酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,对分离纯化的重组几丁质酶进行酶学性质研究。【方法】以弧菌GR52菌株基因组DNA为模板,克隆得到几丁质酶基因GR52-1,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-chi GR52-1,诱导表达的产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应pH为6.0,在pH5.0-10.0范围内37°C保温1 h仍能保持85%以上的相对酶活力,具有较好的pH稳定性;最适反应温度为50°C,在45°C保温1 h其酶活力基本没有损失,在50°C保温1 h其残余酶活力仍达60%;在1 mmol/L浓度下,Cu~(2+)、Ca2+对该酶具有促进作用,Hg+对该酶具有明显的抑制作用;在5 mmol/L浓度下,Ni+对该酶具有一定的促进作用,Mn~(2+)、Co~(2+)、Li~+、Fe~(2+)、Hg~+、SDS(十二烷基硫酸钠)对该酶具有明显的抑制作用。以胶体几丁质为底物时,动力学参数Km、Vmax、kcat分别为0.85 mg/m L、0.19μmol/(m L·min)和7.02 s-1。底物特异性分析表明该重组酶能特异性降解几丁质。【结论】重组几丁质酶具有良好的酶学性质,为几丁质酶的开发应用奠定基础。    

12.  细菌几丁质酶研究进展  被引次数:13
   郑爱萍  李平《中国生物工程杂志》,2002年第22卷第4期
   真菌病害是影响作物产量的重要原因 ,而几丁质酶能有效抑制其生长、水解其细胞壁。对研究较多的细菌几丁质酶及几丁质酶基因的分子生物学研究进展进行了综述 ,并对细菌几丁质酶基因利用存在的问题进行了探讨。    

13.  几丁质酶基因表达载体pET-chiB的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达  被引次数:1
   叶辉  冯春  程郢  朱苏文  程备久《激光生物学报》,2008年第17卷第3期
   几丁质酶在降解几丁质的过程中起着重要作用,目前人们已从不同微生物体中分离并克隆出了多种几丁质酶基因。实验以pET-22b( )为载体,利用从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)克隆出的chiB基因,构建出原核生物表达载体pET-chiB。通过表达载体pET-chiB的诱导表达,实验结果显示该基因表达的蛋白为可溶性蛋白,其分子量约为52 kD。利用不同参数包括时间、IPTG浓度和温度诱导表达载体pET-chiB表达并对表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示其诱导表达的最佳参数分别为4 h,0.5 mmol/L和25℃。这些结果为几丁质酶基因的进一步研究和几丁质酶工程菌生产奠定了良好的工作基础。    

14.  金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae HN1)几丁质酶基因的克隆及高效表达  
   任文彬 张世清 黄俊生《中国生物工程杂志》,2006年第26卷第7期
   几丁质酶是昆虫病原真菌金龟子绿僵菌致病力的主要因子之一。本实验用RT-PCR方法,从本实验室分离筛选到的高毒力金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae HN1中,扩增得到几丁质酶基因全长,此基因全长为1275bp,登录号为DQ011865,经Blastn分析此基因序列与M. anisopliae E6的chi1基因(AF02749)同源率为96% 。以pET-22b(+)为基础载体,构建pET-chi重组表达载体,在大肠杆菌(Escherichia. coli )BL 21中进行表达。经SDS-PAGE分析,获得了42kDa大小的重组目的蛋白,目的蛋白占表达总蛋白含量的63.3%。菌体经冷冻与超声波破碎后,按DNS法可测得几丁质酶的活性。    

15.  植物几丁质酶的研究进展  
   欧阳石文  赵开军  冯兰香  谢丙炎《中国生物工程杂志》,2001年第21卷第4期
   几丁质酶是植物抗真菌基因工程的热点之一。本文叙述了植物几丁质酶的特性、结构和功能、基因结构;按最新资料对以前的植物几丁质酶的分类系统进行了完善;概述了几丁质酶的分子进化的各家观点及其模型,并归纳了植物几丁质酶的生物学作用 。    

16.  植物几丁质酶的研究进展  被引次数:13
   欧阳石文 赵开军 等《生物工程进展》,2001年第21卷第4期
   几丁质酶是植物抗真菌基因工程的热点之一。本文叙述了植物几丁质酶的特性、结构和功能、基因结构;按最新资料对以前的植物几丁质酶的分类系统进行了完善;概述了几丁质酶的分子进化的各家观点及其模型,并归纳了植物几丁质酶的生物学作用。    

17.  植物几丁质酶及其在抗真菌病害中的应用  被引次数:11
   孟亮  崔德才《生物技术通讯》,2004年第15卷第4期
   植物几丁质酶的研究是抗真菌基因工程的热点之一。几丁质酶能够水解真菌细胞壁的主要成分几丁质,在植物抗真菌病害反应中发挥重要的作用。介绍了几丁质酶的基本生物学特性、基因的诱导表达,并对植物几丁质酶基因在抗真菌病害基因工程中的应用进行了阐述。    

18.  桑氏链霉菌几丁质酶ChiKJ40基因的克隆表达及其抑菌作用  
   张博阳  朱天辉  韩珊  王莹  李姝江  谯天敏《微生物学通报》,2018年第5期
   【背景】目前关于桑氏链霉菌(Streptomyces sampsonii)生防基因的研究不多,仅从其基因组中克隆了2个几丁质酶基因片段,其单个几丁质酶的完整基因序列相关研究未见报道。【目的】克隆S.sampsonii KJ40的几丁质酶基因Chi KJ40并进行原核表达,纯化重组蛋白并研究其抑菌作用。【方法】采用PCR扩增法从S.sampsonii KJ40中克隆几丁质酶基因Chi KJ40,连接到表达载体p ET-32a,导入Escherichia coli BL21(DE3)进行诱导表达。使用His标记蛋白质微量纯化试剂盒对重组几丁质酶进行纯化,Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定粗酶液和纯化酶液的浓度,几丁质酶试剂盒测定粗酶液和纯化酶液的几丁质酶活性。观察重组几丁质酶对桉树焦枯病菌(Cylindrocladium scoparium)、栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、链格孢菌(Alternaria alternate)、紫丝核菌(Rhizoctonia violacea)几种致病真菌的抑菌作用。【结果】Chi KJ40基因(登录号为MF434484)在E.coli中经IPTG诱导表达,获得42 k D的重组几丁质酶,不同浓度IPTG在37°C诱导3 h,蛋白产量无明显变化。0.2 mmol/L IPTG 16°C诱导过夜,重组几丁质酶主要以可溶性形式存在于上清,小部分以包涵体存在于沉淀中。粗酶液几丁质酶活性为0.080 U/m L,酶比活力为0.041 U/mg,纯化酶液几丁质酶活性为0.046 U/m L,酶比活力为0.115 U/mg,纯化倍数为2.8,酶活回收率为57.5%。重组几丁质酶处理后,C.scoparium、C.parasitica和A.alternata菌丝细胞出现分节、膨胀,R.violacea菌丝溶解且部分被破坏成碎片。【结论】Chi KJ40基因的研究补充了S.sampsonii的生防背景,为几丁质酶基因找到了新的来源,并为其应用奠定了理论基础。    

19.  几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因研究进展  被引次数:18
   李春娟  单世华  许婷婷  宫清轩《生物技术通讯》,2004年第15卷第5期
   几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶是重要的水解酶,实践证明,转几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因植物能比较有效地抵抗真菌侵染。本综述了几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶结构分类、抗真菌机理.及其近年来在抗黄曲霉病研究中的应嗣研究,并对今后的研究及应用进行了预测。    

20.  嗜热子囊菌原变种Thermoascus aurantiacus var. aurantiacus热稳定几丁质酶的克隆表达及活性研究  
   张婕  谢晨  郭晓红  李多川《菌物学报》,2010年第29卷第5期
   研究通过RT-PCR和Tail-PCR技术从嗜热子囊菌原变种Thermoascus aurantiacus var.aurantiacus中克隆了一个几丁质酶同源基因。该基因全长1,253bp,包含一个由1,197个碱基构成的开放阅读框,编码398个氨基酸。序列比对分析表明,该基因编码蛋白属于糖苷水解酶18家族的几丁质酶。利用基因重组的方法构建酵母分泌型表达载体,并转化毕赤酵母。在甲醇的诱导下,重组蛋白得到了高效表达,第6天的表达量最高,达到0.433g/L,酶活力为28.96U/mg,同时对表达的几丁质酶进行了纯化,SDS-PAGE检测该蛋白的分子量为43.9kDa。该几丁质酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH值为8.0,70℃处理30min仍有45%的相对酶活,具有较好的热稳定性及工业应用价值。    

设为首页 | 免责声明 | 关于勤云 | 加入收藏

Copyright©北京勤云科技发展有限公司  京ICP备09084417号