杧果LEAFY同源基因的分离及序列分析

分析在植物开花过程中起重要作用的LEAFY(LFY)基因的保守区序列,设计1对长度均为23bp的PCR引物,以杧果基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长为822bp的DNA片段,克隆入pGEM-T Easy载体。测序和序列分析表明,获得了杧果LFY同源基因(miLFY)3’端的1个片段,该片段有1个415bp的内含子,编码区共编码135个氨基酸,其序列已经在GenBank中登记(登录号AY189684)。在GenBank中进行同源性检索,发现其氨基酸序列与其它植物LFY同源基因的氨基酸序列同源性高达74%~97%,推测它们具有相似的功能。     

猪POU1F1基因部分序列变异和同源性分析

对长白、杜洛克、约克夏、姜曲海、梅山和香猪等六个猪种的POU1F1基因第四、第五和第六外显子分别进行PCR扩增,并对含有第四、第六外显子的PCR产物和含有第五外显子的克隆产物进行测序。结果表明：六个猪种中,POU1F1基因的第四外显子存在碱基突变,为T→C。对该序列进行Nla Ⅲ 酶消化,产生两种不同的基因型(GG和HH);而第五和第六外显子则高度保守,未发现任何突变。将人POU1F1基因第四外显子、POU同源区核苷酸编码序列和氨基酸序列,分别与猪、小鼠、牛的POU1F1基因相应的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比较,结果发现：人与猪、小鼠、牛的POU1F1基因第四外显子的核苷酸同源性分别高达93.9%、86.7%、92.1%,而由第四外显子编码的部分POU特异区的氨基酸序列则完全一致;人与猪、小鼠、牛POU同源区的核苷酸同源性分别为91.4%、85.1%、87.9%,氨基酸同源性分别为96.6%、94.8%、90.2%。这说明在哺乳动物中,其POU1F1蛋白的POU同源区和由第四外显子编码的POU特异区部分是高度保守的;猪可作为实验动物,建立人类相关疾病模型,为医学研究提供参考依据。     

红树林植物木榄水通道基因的克隆和表达

根据植物水通道基因保守区设计简并引物,采用RT-PCR方法,从木榄树叶中分离出水通道基因的cDNA片段;3′RACE获得3′端cDNA序列;再经5′RACE获得5′端部分cDNA序列,命名为PIP2,GenBank登录号为EF126757。该基因全长843个碱基,编码281个氨基酸,具有典型的植物水通道基因结构。该基因编码的蛋白质与含羞草(PIP2;5)、欧洲葡萄(PIP)、拟南芥(PIP3)等水通道蛋白的同源性分别为90%、91%、88%。Northern杂交分析表明,该基因在木榄树不同器官中的表达差异明显:根部有较高的表达水平,茎部较弱,而在叶中只能检测到微弱的信号。     

枳壳CBF转录激活因子基因片段的克隆

根据不同植物CBF同源基因的保守区设计合成简并引物,采用PCR技术首次从枳壳基因组中分离出一个DNA片段并克隆到pMD18-T载体中.序列测定和分析表明,该片段长464bp,与拟南芥3个CBF基因的核酸序列及其推导的氨基酸序列分别具有79%和67%～69%的同源性,而且推导的氨基酸序列含有同源性更高的AP2DNA结合域和CBF蛋白的两段特征序列PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR.结果 表明,本研究克隆的片段为枳壳CBF基因片段.     

荠菜CRABS CLAW的克隆与拟南芥遗传转化

根据GenBank收录的CRC基因cDNA序列设计引物,以短角果荠菜(Capsella bursa-pastoris)为材料,通过RT-PCR扩增出与拟南芥CRC基因同源的全长cDNA,进行测序、比对及同源性分析.结果显示,克隆的该基因cDNA序列与报道的拟南芥CRC序列一致性达到93%,可以推断其为荠菜CRC基因的cDNA(cbCRC).以Ti质粒pWM101为载体,构建了由CaMV35S启动子调控的cbCRC基因植物表达载体pWM101-cbCRC, 采用根癌农杆菌滴注柱头法转化拟南芥,获得了转cbCRC基因的拟南芥植株.转基因拟南芥心皮果荚形态大小发生了一定的变化,说明荠菜cbCRC基因在拟南芥中的表达对拟南芥心皮形态和大小都产生了一定影响,但其并没有使拟南芥表现出荠菜短角果的形态.     

拟南芥与水稻之间简单重复序列的比较分析

利用Perl,C 语言编写了鉴定和分析简单重复序列的一系列程序,在全基因组水平上分析了拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)简单重复序列的分布及简单重复序列和基因的关系。共发现5652个简单重复序列(≥20bp),大约每20.6kb有1个简单重复序列。拟南芥各染色体之间简单重复序列的密度基本一致。拟南芥的27480条编码序列中,只有677条编码序列含有725个简单重复序列,其中的3碱基简单重复序列多数对应的是小的亲水性的氨基酸。在拟南芥和水稻(OryzasativaL.)第4号染色体的高度保守的基因中,简单重复序列却并不保守。通过比较拟南芥和水稻之间简单重复序列的差异,推论出:水稻的全基因组和基因中简单重复序列的密度都比拟南芥大,这可能是水稻基因组序列比拟南芥大的原因之一,水稻基因组中0.21%来自简单重复序列,而拟南芥中只有0.13%;不但不同物种的基因组对简单重复序列的偏好性不同,而且不同物种的基因对简单重复序列的偏好性也不同。在水稻和拟南芥中都发现了一些嵌套性的卫星序列。     

拟南芥与水稻之间简单重复序列的比较分析

利用Peri,C 语言编写了鉴定和分析简单重复序列的一系列程序,在全基因组水平上分析了拟南芥(Arabidopsisthaliana L.)简单重复序列的分布及简单重复序列和基因的关系.共发现5 652个简单重复序列(≥20bp),大约每20.6kb有1个简单重复序列.拟南芥各染色体之间简单重复序列的密度基本一致.拟南芥的27 480条编码序列中,只有677条编码序列含有725个简单重复序列,其中的3碱基简单重复序列多数对应的是小的亲水性的氨基酸.在拟南芥和水稻(Oryza sativa L.)第4号染色体的高度保守的基因中,简单重复序列却并不保守.通过比较拟南芥和水稻之间简单重复序列的差异,推论出:水稻的全基因组和基因中简单重复序列的密度都比拟南芥大,这可能是水稻基因组序列比拟南芥大的原因之一,水稻基因组中0.21%来自简单重复序列,而拟南芥中只有0.13%;不但不同物种的基因组对简单重复序列的偏好性不同,而且不同物种的基因对简单重复序列的偏好性也不同.在水稻和拟南芥中部发现了一些嵌套性的卫星序列.     

牡丹CTR1基因家族基因片段及其cDNA 3′-末端的克隆与序列分析

以牡丹品种‘洛阳红’(Paeonia suffruticosa‘Luo Yang Hong’)花瓣为材料,用CTAB法提取总RNA,根据已报道的CTR1(Constitutive Triple Response 1)蛋白的保守氨基酸序列设计简并引物,通过RT-PCR扩增得到3条牡丹CTR1基因同源片段。利用其已知中间序列,通过3′快速扩增cDNA末端技术(3′RACE)及序列拼接,最终得到了这3个基因片段除5′末端外的全部cDNA序列,分别命名为PsCTR1、PsCTR2和PsCTR3。分析结果表明,由PsCTR1、PsCTR2和PsCTR3基因翻译的氨基酸片段与拟南芥和番茄的CTR1蛋白氨基酸序列的同源性均较高,分别为88%和85%;61%和61%以及70%和69%。     

蓖麻蚕线粒体基因组细胞色素氧化酶亚基Ⅲ的序列及其分子进化分析

测定了蓖麻蚕Samia cynthia ricini线粒体基因组(mtDNA)含完整的细胞色素氧化酶亚基Ⅲ(COX3)、tRNA-Gly和部分的NADH亚基Ⅲ(ND3)基因的DNA片段序列。COX3基因编码框包含789个核苷酸,编码262个氨基酸的蛋白质。通过同源性比较,发现COX3基因的3′端比5′端要保守,其编码的蛋白在C端有两个保守序列存在。COX3的下游为66 bp的tRNA-Gly基因。蓖麻蚕的COX3与家蚕COX3同源性最高,核苷酸和氨基酸序列同源性分别是80.2%和85.6%。根据COX3氨基酸序列进行了12种无脊椎动物的分子进化树分析,认为在采用线粒体基因序列进行分子进化分析时,应该综合考虑物种的繁殖模式及生态特点。     

犬冠状病毒南京株M基因的同源重组分析

对来自腹泻犬粪样的犬冠状病毒(CCV)南京株NJ17株及参考株171的M基因进行了克隆、测序,并与GenBank中所有已知CCV毒株及同亚群的猪冠状病毒(TGEV)和猫冠状病毒(FCoV)代表株的M基因进行了同源性比较和系统进化分析,同时对M蛋白的结构和功能进行了预测分析。结果表明,CCV171与近年在中国分离到的CCV毒株V1、V2及大熊猫源的毒株具有98.9%～99.5%的同源性,说明这些毒株可能是来自同一毒株的准种。NJ17与其他中国分离株及国外分离株的同源性为87.0%～91.9%,显示国内可能存在一个相对独立进化的CCV毒株。序列比较发现,所有CCV毒株在可能的同源重组“热点”区内都有一个CTTTAG序列,与鸡传染性支气管炎病毒同源重组模板交换位点附近的特征序列相似。CCVNJ17株M蛋白在N端50氨基酸序列与FCoV791683同源性高,而在后212氨基酸序列与TGEV同源性高,提示该毒株可能在M基因上曾经发生过不同病毒的同源重组。CCVM蛋白的结构及功能预测表明,所有毒株都具有分泌型信号肽,有4个螺旋跨膜区,N末端和C末端均位于膜内。M蛋白的两末端具有较强的抗原性,M蛋白上存在多种功能性氨基酸修饰位点且相对保守。N末端的氨基酸变异很大,但是功能性修饰位点相对保守,提示N末端的功能可能与构象有关。     

Isolation and characterization of a novel dehydrin gene from Capsella bursa-pastoris

A novel dehydrin gene designated as Cbcor29 was cloned from Capsella bursa-pastoris by rapid amplification of cDNA ends (RACE) and genome walker technique. The full-length cDNA of Cbcor29 was 1101 bp long with a 783 bp open reading frame (ORF), encoding a putative protein of 261 amino acids. Like other dehydrin proteins, CbCOR29 contained a high percentage of charged and polar amino acids, in which Cys and Trp amino acids were absent. Besides, predicted CbCOR29 protein possesses three conserved repeats of the characterized Lys-rich domains (K-segments), and a Ser-rich domain (S-segment) prior to the first Lys-rich domain, which presented a typical SK3 structure of dehydrins. Analysis of Cbcor29 genomic DNA revealed that it contained 2 exons and 1 intron, which was a typical character of dehydrin genes. Subsequent bioinformatic analysis also showed that the sequence of CbCOR29 had high homology with other dehydrin proteins, especially with cor47 from Arabidopsis thaliana. Moreover, semi-quantitative RT-PCR revealed that the expression of Cbcor29 could be induced by exposure to drought, low-temperature, NaCl and exogenous ABA treatment respectively. Our study implied that the Cbcor29 gene was a new member of the dehydrin gene family and might exert functions in drought-, cold- and salt- responsiveness in Capsella bursa-pastoris.     

毛白杨PtFT1和PtFT2基因编码区克隆与表达模式分析

以毛白杨为材料,采用同源基因克隆法从毛白杨中分离了FT(FLOWERING LOCUS T)同源基因PtFT1和PtFT2编码区序列。测序结果表明PtFT1和PtFT2 编码区长度均为525bp,可编码174个氨基酸。蛋白序列比对发现这两个基因与拟南芥、葡萄等物种中FT同源基因所编码的氨基酸同源性达到75%以上, PtFT1 和 PtFT2 所推测的氨基酸序列包含FT类蛋白保守基序(LGRQTVYAPGWRQN)和两个关键性氨基酸残基Tyr84(Y),Gln139(Q)。系统进化分析进一步表明 PtFT1 和 PtFT2 属于FT亚家族成员。采用Real-time qRT-PCR技术检测 PtFT1 和 PtFT2 在各个组织部位中的表达模式,结果表明 PtFT1 和 PtFT2 在各个组织部位均有表达,但这两个基因的表达水平存在差异;两个基因在早期雌雄花芽(7月5日)表达量明显高于成熟雌雄花芽(翌年3月10日)表达量,进而推测在毛白杨中 PtFT1 和 PtFT2 的表达响应日照长短,长日照条件促进这两个基因的表达,它们可能在光周期调控的开花途径中促进花芽分化和开花发挥特定作用。这些研究对于阐明 PtFT1 和 PtFT2 在光周期开花调控途径中的作用机制具有重要意义,为进一步开展毛白杨开花调控基因工程研究奠定了工作基础。     

小麦中雄性不育同源序列的分离、鉴定及表达分析

利用拟南芥中已克隆的雄性核不育基因MS2和水稻中假定雄性不育蛋白的保守区域,设计一对简并引物,并在太谷核不育小麦可育株及不育株花药中进行扩增,得到了一条134bp的片段。以该片段为基础,通过电子延伸得到一个长为1604bp的序列,该序列编码的氨基酸包含一段由200个氨基酸组成的雄性不育保守区。RT-PCR结果表明,该雄性不育同源序列只在小麦可育花药中表达,而在小麦败育花药、叶片和根中不表达,说明该雄性不育同源序列为花药发育特异基因。     

Isolation and identification by sequence homology of a putative cytosine methyltransferase from Arabidopsis thaliana.

A plant cytosine methyltransferase cDNA was isolated using degenerate oligonucleotides, based on homology between prokaryote and mouse methyltransferases, and PCR to amplify a short fragment of a methyltransferase gene. A fragment of the predicted size was amplified from genomic DNA from Arabidopsis thaliana. Overlapping cDNA clones, some with homology to the PCR amplified fragment, were identified and sequenced. The assembled nucleic acid sequence is 4720 bp and encodes a protein of 1534 amino acids which has significant homology to prokaryote and mammalian cytosine methyltransferases. Like mammalian methylases, this enzyme has a C terminal methyltransferase domain linked to a second larger domain. The Arabidopsis methylase has eight of the ten conserved sequence motifs found in prokaryote cytosine-5 methyltransferases and shows 50% homology to the murine enzyme in the methyltransferase domain. The amino terminal domain is only 24% homologous to the murine enzyme and lacks the zinc binding region that has been found in methyltransferases from both mouse and man. In contrast to mouse where a single methyltransferase gene has been identified, a small multigene family with homology to the region amplified in PCR has been identified in Arabidopsis thaliana.     

The C1orf9 gene encodes a putative transmembrane member of a novel protein family

Here we report the characterization of a human mRNA encoding a novel protein denoted C1orf9 (chromosome 1 open reading frame 9). The cDNA sequence, derived from a testis cDNA library, contains 5700 bp which encodes an open reading frame of 1254 amino acids. The deduced protein contains a putative N-terminal signal peptide and one putative transmembrane region, indicating membrane localization. No significant homology was found with known characterized proteins. However, a 150 amino acid region has significant homology to deduced protein sequences from other organisms, including Caenorhabditis elegans (43% identity), Saccharomyces cerevisiae (47% identity), Schizosaccharomyces pombe (48% identity), and two proteins from Arabidopsis thaliana (42% and 40% identity), suggesting a novel family of conserved domains. The C1orf9 gene was assigned to chromosome 1q24. The gene spans approximately 78.7 kb and is organized into at least 24 exons. Expression analysis revealed a single C1orf9 mRNA species of approximately 6.0 kb with a predominant expression in pancreas and testis, and only low levels of expression in other tissues examined.     

一步法RT—PCR克隆水稻线粒体磷转运蛋白基因及其序列特征分析

以水稻广亲和品种Cpslo17幼穗为材料,用一步法RT—PCR（逆转录聚合酶链式反应）克隆了一个长度为1118bp的编码线粒体磷转运蛋白的OsMPT基因。序列分析表明其包含了基因完整的编码序列,编码由368个氨基酸组成的线粒体磷转运蛋白,它与玉米、大豆、Lotus japonicus、Betula pendula、拟南芥的线粒体磷转运蛋白氨基酸序列相似率分别为93．5％,85．6％,83．8％,83．7％,81．1％。氨基酸疏水谱分析显示它有线粒体磷转运蛋白家族高度保守的6个跨膜结构域。水稻线粒体磷转运蛋白N端富含精氨酸（Arginine）、丙氨酸（Alanine）和丝氨酸（Serine）。iPSORT预测其蛋白N端具有定位于线粒体的信号肽序列,进一步分析表明此编码区段有6个外显子和5个内含子。RT—PCR结果表明,OsMPT基因在水稻两个亚种粳稻和籼稻的叶片中均有表达,在Cpslo17营养器官和生殖器官中都有高水平表达。水稻线粒体磷转运蛋白的克隆和表达分析将为研究其结构和生物学功能奠定基础。     

一个新的茶树黄酮醇合酶基因的克隆和表达分析

Cs—COR113（GenBank登录号：FE942098）为一受冷诱导的茶树黄酮醇合酶基因的cDNA片段,采用RACE技术克隆了这一基因的全长cDNA,命名为CsFLS（GenBank登录号：FJ577509）。CsFLScDNA序列全长为1303bp,5＇-UTR和3’-UTR分别长91bp和175bp,包含一个编码336个氨基酸的完整开放阅读框。序列分析显示,CsFLS与烟草、矮牵牛、欧芹、拟南芥的黄酮醇合酶的同源性分别为74％、75％、75％和63％,含有2-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族2个保守的基序,以及与黄酮醇合酶正确折叠有关的2个保守的甘氨酸残基。CsFLS的表达受低温诱导,但不受ABA诱导。