白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白表达纯化及活性研究

[目的]采用大肠杆菌表达白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白,表达纯化后进行抗细胞黏附活性及抑制凝血酶活性的功能研究.[方法]将编码白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白的基因构建到pET28a载体上,转化菌株Rosetta(DE3)并经IPTG诱导表达后分别经镍柱和分子筛进一步纯化,使用实时细胞分析仪和血凝仪分别测定了白细胞抑制因...     

拟蜘蛛拖丝蛋白基因重组蛋白的纯化及其抗血清制备

为了制备可用于拟蜘蛛拖丝蛋白体外检测的抗血清,利用前期工作中获得的蜘蛛拖丝蛋白基因重组原核表达载体2S-pET-52b( + ),采用原核表达方法获得大量重组蜘蛛拖丝蛋白2S-His,对此重组蛋白进行His标签特异性的亲和纯化,再依次经SDS-PAGE、切胶和与佐剂混合后作为抗原;皮下多点注射法将抗原注入新西兰大白兔皮...     

鼻咽癌组织p53相关蛋白的纯化

鼻咽癌是南方常见的恶性肿瘤,ＮＰＣ与ＥＢ病毒关系十分密切。通过免疫亲和层析的方法了解ＮＰＣ肿瘤标本中ｐ５３与病毒或细胞蛋白间潜在的相互作用。这种相互作用可能引起Ｐ５３在ＮＰＣ组织中累积。建立单克隆抗体ｐＡｂ１８０１,ｐＡｂ２４０１免疫亲和层析柱,从ＮＰＣ转移淋巴结分离ｐ５３结合蛋白。     

PTEN蛋白磷酸酶活性的作用

PTEN是一个具有磷酸酶活性的肿瘤抑制基因,是编码具有脂质磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性的双重特异性磷酸酶,其缺失或功能异常与人类恶性肿瘤的发生发展密切相关。PTEN的脂质磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性在调控肿瘤细胞的生物学行为、维持细胞正常的生理活动中均发挥了重要作用。但二者的作用重点及机制仍有不同,其蛋白磷酸酶活性主要侧重于调控细胞的黏附迁移及侵袭。为更好地认识PTEN蛋白磷酸酶活性的作用,该文对PTEN蛋白磷酸酶活性的作用及其机制作一简要综述。     

IMPACT-TWIN蛋白纯化系统的机制及其应用

IMPACT-TWIN系统是一种新型的蛋白融合表达及纯化系统,已被应用到蛋白质工程的众多领域。此系统中目的蛋白与蛋白自剪接元件intein及几丁质结合蛋白域CBD构成融合蛋白,利用几丁质亲和层析柱,通过诱导内含肽的肽键裂解活性,使目的蛋白释放出来,而内含肽与几丁质结合蛋白仍结合在几丁质介质上,实现了单柱分离纯化蛋白。本文主要阐述了IMPACT-TWIN蛋白表达纯化系统的机制、特点,以及其在蛋白表达纯化方面应用的最新进展。     

硫氧还蛋白抗体柱的制备

目的:探索硫氧还蛋白(Trx)抗体柱对Trx融合蛋白纯化的可行性。方法与结果:对含有Trx基因的质粒表达载体pTrxFus进行改造,在Trx读框之后加入6×His序列,并在大肠杆菌中表达C端带有6×His标签的Trx,经Ni2+柱亲和纯化后制备多克隆抗体;把经蛋白A纯化后的抗体偶联在溴化氰活化的琼脂糖凝胶上,制成Trx抗体柱;用此抗体柱纯化与Trx融合表达的豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI),SDS-PAGE结果显示获得了纯度较高的Trx-CpTI。结论:用Trx抗体制成的免疫亲和层析柱可以有效纯化Trx融合蛋白。     

新型载体蛋白P64K在大肠杆菌中的可溶性表达与纯化

用常规PCR方法从脑膜炎球菌中克隆出P64K基因,构建重组质粒pET28a-P64K转化BL21(DE3)宿主菌,经眦诱导表达筛选P64K蛋白的高表达菌株。结果证实P64K蛋白为胞内可溶性表达,表达量约占胞内总蛋白的30％。重组P64K蛋白经Butyl疏水柱、G200分子筛柱和Q阴离子柱三步层析后纯度达到95％以上,为今后进一步的功能和应用研究打下了良好的基础。     

磷酸酪氨酸蛋白专一抗体的制备和纯化

以偶联磷酸化酪氨酸的牛血清白蛋白（ＢＳＡ）作为免疫原免疫兔获得抗血清．自抗血清中分离获得抗体．自酪胺合成磷酸酪胺,并偶联到溴化氰活化的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ上．抗体经磷酸酪胺－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和柱纯化,所得抗体专一性强,Ｄｏｔｂｌｏｔ显示：抗体仅对酪氨酸磷酸化的蛋白质包括酪氨酸磷酸化的血清白蛋白,溶菌酶,卵清蛋白起抗原抗体反应,而不识别非酪氨酸磷酸化的溶菌酶,卵清蛋白,也不识别作为免疫原的骨架成分ＢＳＡ,也不识别丝氨酸磷酸化的卵清蛋白和苏氨酸磷酸化的卵清蛋白．     

拟南芥VSP2蛋白的重组表达及其酸性磷酸酶活性的测定

通过PCR扩增从拟南芥cDNA文库中得到VSP2蛋白的编码序列,将其构建到原核表达载体pET-22b上,并在大肠杆菌BL21菌株中实现高效可溶表达。经过Ni-NTA亲和层析一步纯化,获得电泳纯的重组VSP2蛋白。以pNPP为底物检测,该蛋白具有酸性磷酸酶活性,反应的最适pH值4.5,最适温度为45oC,Km值为26.2mM。重组VSP2蛋白表达量高,纯化后均一性好,适于蛋白晶体生长。     

Human cytochrome P450 4F11: Heterologous expression in bacteria, purification, and characterization of catalytic function

Human cytochrome P450 (P450) 4F11 is still considered an “orphan” because its function is not well characterized. A bacterial expression system was developed for human P450 4F11, producing ∼230 nmol P450 from a 3-l culture of Escherichia coli. P450 4F11 was purified and utilized for untargeted substrate searches in human liver extract using a liquid chromatography/mass spectrometry-based metabolomic and isotopic labeling approach (Tang et al., 2009 [19]). Four fatty acids—palmitic, oleic, arachidonic, and docosahexaenoic—were identified in human liver and verified as substrates of P450 4F11. The products were characterized as ω-hydroxylated fatty acids by gas chromatography-mass spectrometry analysis of their trimethylsilyl derivatives. Kinetic analysis of the oxidation products confirmed that the fatty acids are substrates oxidized by P450 4F11. P450 4F11 also exhibited low activity for some drug N-demethylation reactions but none for activation of several pro-carcinogens.     

P40蛋白在大肠杆菌内的表达及初步纯化

P40蛋白是我们新发现的 p40基因编码的一种含有 357个氨基酸残基的蛋白质 (另文发表 ) .有关专家们预言 ,随着人类基因组计划的完成 ,基因后时代即蛋白时代即将来临 .拥有新基因并不是我们的最终目的 ,只是在我们的科研工作中开拓了一个新领域 .对新基因功能的研究必需获得其编码的蛋白质 .p40基因是我们从正常人脑内克隆的一个脑内高表达的新基因 .脑是人体内功能最为奥秘的器官 ,对脑内新基因的发现和功能研究是揭示脑功能的必经之路 .获得 P40蛋白是我们研究 p40基因的第一步 .该蛋白可用于免疫动物以获得多克隆抗体 ,为今后的研究工作 …     

核酸酶P1的原核表达、纯化及酶学特性分析

为了建立一种核酸酶P1(Nuclease P1,NP1)的原核表达纯化系统,首先采用重叠延伸PCR将22段寡核苷酸拼接,获得人工合成的NP1基因。将其克隆至分泌型表达载体pMAL-p4X获得重组质粒pMAL-p4X-NP1,然后将重组载体转化T7 Express和Origami B(DE3)菌株诱导表达,利用Amylose亲和层析柱纯化获得重组蛋白,并对其活性、热稳定性和金属离子依赖性进行系统分析。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白MBP-NP1(Maltose binding protein-NP1)在T7 Express和Origami B(DE3)菌株中均可表达,且以可溶性形式存在。活性检测表明Origami B(DE3)菌株中获得的重组蛋白活性高于T7 Express菌株(75.48 U/mg:51.50 U/mg);利用蛋白酶Factor Xa切除MBP标签后,两种重组蛋白的比活力均有提高,分别为258.13 U/mg和139.20 U/mg。重组NP1表现出良好的热稳定性,80℃温浴30 min后重组酶仍具有90%以上的活力。2.0 mmol/L Zn2+对NP1有比较明显的激活作用,相同浓度的Cu2+则对该酶有强烈的抑制作用。该研究实现了NP1在大肠杆菌系统中的功能性表达,为NP1纯酶的制备提供一个替代途径。     

八肋游仆虫酸性核糖体磷酸化蛋白P1有2个亚型

真核生物酸性核糖体磷酸化蛋白(P0、P1、P2)位于核糖体60S大亚基上,它们在核糖体上共同组成一个向外侧凸出的五聚体的柄状复合物［P0·(P1·P2)2］,该复合物在蛋白质合成延伸过程中起着重要作用．为了探讨单细胞真核生物核糖体柄状复合物的组成形式及在蛋白质合成中的作用,对八肋游仆虫（Euplotes octocarinatus）的P1进行了研究．通过生物信息学方法,分析八肋游仆虫基因组及转录组数据,找到2个酸性核糖体蛋白P1基因,从DNA 和cDNA中都扩增到这2个P1基因,表明八肋游仆虫酸性核糖体磷酸化蛋白P1确实存在2个亚型. 将2个基因克隆后分别构建重组表达质粒pET28a-P1A和pGEX-6P-1-P1B,在大肠杆菌BL21中获得高效表达.经镍柱和GST柱亲和层析后,获得较高纯度的八肋游仆虫酸性核糖体蛋白EoP1A和EoP1B,表达产物经Western印迹检测为阳性．Pull-down分析了EoP1A和EoP1B之间的相互作用．结果表明,游仆虫酸性核糖体磷酸化蛋白P1的2个亚型EoP1A和EoP1B之间存在相互作用.     

钩端螺旋体liprmA基因的表达及其产物的纯化与功能分析

以钩端螺旋体基因组DNA为模板,通过酶联聚合反应（PCR）得到钩端螺旋体中prmA的同源基因liprmA的全基因编码序列,并克隆到原核表达载体pET22b中。通过优化大肠杆菌培养和诱导条件,含目的蛋白的融合蛋白可溶表达量达到40 mg/L,约占菌体总蛋白的40%。经Ni-NTA His Bind亲和柱纯化,得到纯度大于95%的目的蛋白。氨基酸序列同源性分析显示liPrmA与原核生物和真核生物的核糖体蛋白L11甲基化转移酶的功能域一级结构高度一致;活性分析显示,纯化的liPrmA有钩端螺旋体核糖体蛋白L11甲基化转移酶的活性。     

人硫氧还蛋白在大肠杆菌中的高效表达、纯化及对内毒素血症小鼠的保护作用

为了对人硫氧还蛋白hTRX功能及其在休克治疗前景进行评价 ,将PCR扩增的hTRX基因连入pKPL 4载体 ,转化大肠杆菌pop2 136 .通过两步离子交换柱分离得到纯化的蛋白 ,进一步观察其稳定性及在体外对NFS 6 0和MCF 7细胞的促增殖活性 .结果发现 ,TRX蛋白可明显促进去细胞因子诱导的NFS 6 0细胞增殖和撤血清后MCF 7细胞的增殖 ,并发现外源性TRX可明显对小鼠内毒素血症起保护作用 .     

ENC1的克隆,原核表达与数种细胞系表达谱分析

以人 3月胎脑总RNA为模板 ,用RT PCR的方法得到了ENC1(ectoderm neuralcortex 1)基因的cDNA ,经测序证实该cDNA的长度为 180 0bp ,包含ENC1的完整编码区 .将之克隆入pGEX 4T 1载体构建重组表达质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1表达 ,经Sepharose 4B纯化得到目的蛋白 .通过Northern印迹和RT PCR检验了该基因在数种细胞系中的表达 ,结果表明其在神经胶质母细胞瘤细胞系U2 5 1中有较高的表达 ,而在包括神经母细胞瘤细胞系SH SY5Y的其他数种细胞系中无表达 .与在正常生理状态下神经系统中两种细胞的表达情况相反 .这种分布不同的情况提示了ENC1在这两种不同来源的肿瘤的发生发展中具有不同作用     

类泛素化修饰蛋白SUMO1的表达纯化及抗体制备

SUMO是近年发现的类泛素化修饰蛋白,可通过异肽键共价连接到靶蛋白上,影响靶蛋白的细胞内定位、稳定性及与其它生物大分子的相互作用. 为研究蛋白质的SUMO化修饰,本文表达并利用亲和层析的方法纯化了重组的人SUMO1,制备了兔抗hSUMO1的多克隆抗体. 经ELISA和免疫印迹检测,获得了灵敏度高、特异性好的抗体,可用于SUMO化修饰靶蛋白的鉴定及SUMO化修饰的生物学功能研究.     

Soluble expression of aggregating proteins by covalent coupling to the ribosome

Ribosomes are extremely soluble ribonucleoprotein complexes. Heterologous target proteins were fused to ribosomal protein L23 (rpL23) and expressed in an rpL23 deficient Escherichia coli strain. This enabled the isolation of 70S ribosomes with covalently bound target protein. Isolation of recombinant proteins from 70S ribosomes was achieved by specific proteolytic cleavage followed by efficient removal of ribosomes by centrifugation. By this procedure we isolated active green fluorescent protein, streptavidin (SA), and murine interleukin-6 (mIL-6). Approximately 500microg of each protein was isolated per gram cellular wet weight. By pull-down assays we demonstrate that SA covalently bound to the ribosome binds d-biotin. Ribosomal coupling is therefore suggested as a method for the investigation of protein interactions. The presented strategy is in particular efficient for the expression, purification, and investigation of proteins forming inclusion bodies in the E. coli cytoplasm.     

转谷氨酰胺酶基因在大肠杆菌中的克隆表达

从轮枝链霉菌Streptoverticilliummobaraense细胞中获得其基因组DNA ,用一对特异性的引物通过PCR的方法扩增出转谷氨酰胺酶 (transglutaminase,TGase)全长基因 ,回收片段并将其连接到表达载体pET30a中 ,转化大肠杆菌DH5α。双向测序表明获得的转谷氨酰胺酶全长基因序列正确。纯化重组质粒转化大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,以 1mmol/LIPTG诱导 5h收集菌体进行SDS-PAGE电泳分析 ,与阴性对照相比 ,明显多出了一条蛋白条带 ,紫外扫描显示此带约占总蛋白量的1 7% ,Westernblotting证实此带能够特异性地与兔抗MTG(味之素公司 )的抗体发生反应。测得纯化后得到的TGase蛋白的酶活可以达到 15.1U/mg蛋白。