猪圆环病毒Ⅱ型SC株ORF3基因克隆及其编码蛋白的生物信息学分析

本研究根据GenBank登录的猪圆环病毒基因组序列(DQ180392.1)来设计引物,用PCR法扩增出PCV-2四川株(PCV-2SC)ORF3基因,并克隆到PMD19-T载体进行测序,同时利用在线生物信息学软件及数据库对ORF3基因及其编码蛋白进行生物信息学分析。研究结果表明,成功构建了命名为P-S-PCV-2SCORF3的重组质粒;测序结果得知PCV-2SCORF3基因全长315bp,共编码104个氨基酸;BLAST比对发现该基因与GenBank中国内外参考毒株核苷酸同源性在98%~100%之间。利用在线生物信息学软件对PCV-2SCORF3编码蛋白结构特征进行分析,发现该蛋白含有12个潜在的磷酸化位点,ORF3成熟蛋白有4个主要的抗原位点;亚细胞定位分析结果表明,编码蛋白主要存在于线粒体中和细胞核中并各占43.5%和34.8%,这证实了PCV-2SCORF3编码蛋白属于胞质蛋白,抗原区位集中于胞膜,有向胞核移动的趋势,功能强大,可能与细胞凋亡有关。疏水性分析发现,该编码蛋白具有一定的疏水性,与该蛋白的表面抗原决定族和膜蛋白中穿越膜的肽片段及该蛋白的高级结构的形成有关,预示其高疏水性区又与膜蛋白的跨膜区有着明显相关性。本研究成功进行了PCV-2SCORF3基因的克隆和生物信息学分析,为今后研究此基因的生物学功能以及研究该病毒疫苗的方法奠定理论基础。     

单壁碳纳米管载锦鲤疱疹病毒ORF149核酸疫苗的构建

为了开发新型高效疫苗预防锦鲤疱疹病毒病,以单壁碳纳米管(SWCNT)作为运输载体,构建锦鲤疱疹病毒(KHV)ORF149核酸疫苗。首先构建pcDNA3.1(+)-ORF149重组质粒,通过瞬时转染和免疫印迹分析确定其表达情况,然后通过1,3-偶极环加成反应法将重组质粒与SWCNTs进行偶联,最后通过扫描电镜观察和核酸电泳鉴定其偶联是否成功。结果表明,构建的重组质粒转染细胞后经免疫印迹分析和间接免疫荧光试验均能检测到特异性信号;在核酸琼脂糖凝胶电泳中,构建的重组疫苗电泳条带消失;在场发射扫描电镜观察下,与重组质粒进行偶联的SWCNTs和空白SWCNTs形态差异明显。     

文蛤MmASS基因克隆及生物信息学分析

利用RACE技术克隆获得文蛤精氨酸琥珀酸合成酶基因(MmASS)的cDNA序列全长,该基因全长为1 588 bp,共编码415个氨基酸,分子量为46.81 kD,理论等电点pI为5.51。预测蛋白序列包含6个保守区域,主要集中了ATP结合位点、天门冬氨酸L-Asp结合位点以及瓜氨酸L-Cit结合位点。氨基酸序列比对结果显示,MmASS蛋白序列的保守功能域与其他物种具有较高的相似度,说明该基因高度保守,可能与其他物种的ASS基因具有相似的功能。系统进化树分析结果表明,MmASS的预测蛋白序列与缢蛏、贻贝、牡蛎等双壳贝类的亲缘关系最近,符合进化规律。亚细胞定位预测结果显示,MmASS定位于细胞质的可能性最大。MmASS不同组织的表达特征结果显示,该基因在各个组织中广泛存在,在文蛤鳃组织中的表达量最高(P<0.05),其次是肝胰腺组织,由此推测MmASS参与调节文蛤各个组织的生理活动,可能在文蛤的免疫防御机制中发挥重要功能。     

羊口疮病毒安徽株VIR基因克隆与生物信息学分析

目的 获取并分析ORFV AH-F10株VIR基因序列及预测其编码蛋白的生物信息学特点。方法 利用实验室保存的羊口疮AH-F10株,设计VIR基因引物并进行PCR扩增、克隆及序列测定,同时利用生物信息学方法对其编码的蛋白的理化性质、二级结构、三级结构、信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域以及线性细胞表位进行预测。结果 AH-F10-VIR基因长552 bp,编码183个氨基酸,与Nantou株的VIR基因同源性最高,核苷酸同源性高达99.6%,氨基酸同源性为100.0%。生物信息学分析结果显示编码的蛋白相对分子量为19.88 kDa,等电点为4.83,为亲水性蛋白;α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链分别占36.07%、3.83%、43.17%和16.94%;三级结构预测显示VIR蛋白存在较多的α-螺旋与无规则卷曲,同二级结构预测结果相符;含有17个磷酸化位点,无信号肽和跨膜结构区域,有15个潜在的B细胞优势表位,4个CTL细胞表位以及5个Th细胞表位。结论 成功克隆了羊口疮安徽株VIR基因并预测了VIR蛋白的生物信息学相关信息,为进一步研究VIR蛋白奠定了基础。     

库尔勒香梨PsLOX基因克隆及生物信息学分析

克隆了库尔勒香梨（Pyrus sinkiangensis Yü）脂氧合酶（lipoxygenase,LOX）基因PsLOX,了解其在香梨果实不同发育时期的表达差异,为香梨果实香气代谢机理研究提供理论依据。以库尔勒香梨嫩叶及不同时期果实表皮为试材,利用两种不同的方法提取总RNA,通过RT-PCR技术得到目的基因PsLOX的cDNA序列,以生物信息学方法对其进行分析和功能预测。运用半定量RT-PCR （SqRT-PCR）技术,分析PsLOX基因在香梨嫩叶及果实生长发育及货架期的表达特性和差异。结果：试剂盒提取总RNA质量较高,PsLOX基因CDS序列为912 bp,编码303个氨基酸,属于脂氧合酶家族基因,与其他植物LOX基因编码的氨基酸序列有较高的同源性,与南果梨相似性最高,达到99%;PsLOX基因在香梨果实中发育过程中表达差异明显,即生长发育前期表达量很低,成熟至完熟时期表达量最高,然后开始减少。推测克隆获得PsLOX基因在香梨果实香气代谢过程中起到重要作用。     

沙眼衣原体PmpH基因克隆及生物信息学分析

[目的]克隆沙眼衣原体PmpH基因并进行生物信息学分析。[方法]以沙眼衣原体核酸检测阳性泌尿生殖道标本为研究对象,设计引物扩增PmpH基因,克隆、测序后获得其全长核酸序列,应用生物信息方法预测分析编码蛋白的理化性质、主要结构域、结构及B细胞抗原表位。[结果] PCR扩增出沙眼衣原体PmpH基因,克隆并测序后获得PmpH基因核酸序列,长度为3 051 bp,预测PmpH蛋白理论分子质量为107.898 ku,等电点为6.05,该蛋白具有信号肽和2个结构域。PmpH蛋白二级结构主要为无规则卷曲,占比高达50.69%。预测该蛋白含有34条线性B细胞表位,其中氨基酸数大于7的有26个。[结论]克隆得到沙眼衣原体PmpH基因,预测PmpH蛋白分子量为107.898 ku,二级结构主要为无规则卷曲,含有34条线性B细胞表位(大于7个氨基酸的有26个)。     

海岛棉GbHCT基因克隆及生物信息学分析

克隆海岛棉木质素合成关键酶基因GbHCT全长cDNA序列,分析其在纤维不同发育时期的表达情况。根据海岛棉转录组数据中的HCT序列设计引物,采用RT-PCR技术克隆基因,通过生物信息学方法分析GbHCT的cDNA序列和氨基酸序列。通过分析转录组数据研究GbHCT在纤维不同发育时期的表达。从海岛棉中克隆了1个编码HCT的基因GbHCT,开放阅读框长度为1311bp,编码436个氨基酸,蛋白质分子量为48.58kD,等电点为6.03。GbHCT氨基酸序列中含有HTLGD和DFGWG2个保守基序。GbHCT氨基酸与陆地棉、亚洲棉和雷蒙德氏棉HCT一致性较高,与其他植物中的HCT氨基酸的一致性为55.7%-60.7%。转录组数据分析发现GbHCT在纤维不同发育阶段都有表达,在5DPA的纤维中表达量最高,表明该基因可能参与棉花纤维的发育。     

人精氨酸酶Ⅰ基因克隆及生物信息学分析

[目的]克隆人精氨酸酶Ⅰ(human-ARGⅠ)基因并分析其生物学特性。[方法]根据NCBI数据库提供的人精氨酸酶Ⅰ基因序列设计其特异性引物,利用PCR扩增目的基因,并将其连接到p CMV-MYC载体上并利用生物信息学工具分析人精氨酸酶Ⅰ蛋白的生物学特性。[结果]酶切鉴定与DNA测序结果显示人精氨酸酶Ⅰ基因全长969bp,编码322个氨基酸残基;人精氨酸酶Ⅰ蛋白属于精氨酸酶——组蛋白去乙酰化酶超家族,是位于细胞质中的稳定亲水性蛋白,无信号肽,不含跨膜结构域,其二级结构由无规则卷曲,α-螺旋和延伸链构成,并且三级结构与二级结构预测结果高度一致,建模结果准确可靠。[结论]人精氨酸酶Ⅰ基因全长969 bp,编码322个氨基酸残基,分子量为34 734. 94,p I 6. 72,其氨基酸序列中无信号肽,无跨膜结构域,是非分泌型及亲水性蛋白,是属于精氨酸酶-组蛋白去乙酰化酶超家族,无规则卷曲为二级结构中最主要的结构元件,并且三级结构与二级结构预测结果高度一致,建模结果准确可靠。     

小鼠Neto2基因克隆及生物信息学分析

[目的]克隆并生物信息学分析小鼠Neto2基因。[方法]]通过RT-PCR方法从小鼠脑组织中克隆Neto2基因,利用生物信息学工具对其理化性质、蛋白结构和系统进化进行分析。[结果]成功构建载体pMD19T-m Neto2。小鼠Neto2基因CDS全长1 662 bp,编码553个氨基酸,该蛋白分子式为C2776H4312N762O826S32,相对分子质量62.6 k Da,等电点为7.18。结构分析显示,小鼠Neto2蛋白二级结构以无规卷曲为主(54.25%),该蛋白有两个跨膜区域及磷酸化修饰位点,无信号肽。小鼠Neto2与Grik2、Necab3、Kars、Grip1等蛋白存在相互作用。[结论]小鼠Neto2蛋白是含553个氨基酸残基的亲水蛋白,含62个磷酸化位点,参与调节神经生长发育、兴奋性神经递质传递、学习记忆等生物学功能。     

沙眼衣原体LpxA基因克隆及生物信息学分析

[目的]克隆沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)LpxA基因并分析其生物学特性。[方法]根据Ct LpxA基因序列设计特异性引物,利用PCR扩增LpxA基因,并把LpxA基因连接到p MD18-T载体,挑取阳性克隆进行PCR和DNA测序验证。最后使用生物信息学软件分析LpxA蛋白的生物学性质。[结果]从Ct基因组中PCR扩增得到840 bp的Ct LpxA基因,该基因共编码280个氨基酸。LpxA蛋白无信号肽,定位在细菌细胞质。二级结构预测得知α-螺旋占19.6%,延伸链占32.8%,β-转角为11.4%,无规卷曲为36%。三级结构预测得知3个相同的LpxA分子组成同源三聚体。预测得知LpxA蛋白有11个B细胞表位。[结论]克隆得到Ct LpxA基因,并预测了其结构和功能。     

对PRRSV的YA株ORF 5基因克隆与系列分析的意义

猪繁殖与呼吸综合征是由此综合征病毒PRRSV引起严重危害养猪业的一种新型传染病。其特征为母猪流产、死胎、木乃伊、弱仔等繁殖障碍、仔猪呼吸道症状明显及其高死亡率。此病目前进行大规模防治比较困难 ,但在我国又普遍存在。经临床和血清学调查 ,PRRSV属动脉类病毒科 ,为单股正链RNA病毒 ,其基因组大小为 15kb ,包括 8个开放阅读框架 ,可编码 6种结构蛋白和两种非结构蛋白。其中ORF5编码病毒的糖基化囊膜蛋白又称E蛋白和 gp5是主要的结构蛋白 ,有许多功能 ,并能参与细胞免疫和体液免疫 ,还可诱导细胞凋亡 ,同时有中和作用 ,并与 gp5…     

陆川猪SOCS3基因克隆及生物信息学分析

细胞因子信号通路抑制因子3(SOCS3)是一类调节机体免疫和神经内分泌功能的生物活性物质。本研究以陆川猪背最长肌cDNA为模板,克隆获得了SOCS3基因编码区序列(CDS)。序列分析结果显示,陆川猪SOCS3基因CDS全长为690 bp,与Gen Bank中公布的长白猪的CDS的同源性为99.9%,并发现存在第70位点的A→G,碱基G为陆川猪所特有,导致苏氨酸突变为丙氨酸。陆川猪SOCS3基因CDS与Gen Bank上已经公布的马、犬、人、牛、大熊猫、河狸、猕猴、小鼠的SOCS3基因CDS进行比对,发现它们的同源性依次为95.5%、95.1%、95.0%、94.3%、94.2%、93.2%、92.5%和90.4%。构建SOCS3基因系统进化树的结果表明,与陆川猪遗传距离最近的是长白猪,最远是小鼠;陆川猪SOCS3蛋白的高级结构中包含有α螺旋、β折叠、无规卷曲和延伸链。本研究为今后探讨SOCS3基因在陆川猪肌肉生长发育、脂肪沉积、抗热应激能力的分子机制提供科学理论依据。     

南疆PRRSV ORF3基因克隆与序列分析

旨在掌握南疆PRRSV流行毒株特点,为南疆PRRS的有效预防和控制提供理论依据.利用克隆和测序获得了5个南疆PRRSV ORF3基因全序列,并进行了序列分析.结果显示,5个南疆PRRSV ORF3基因长度均为765 bp,他们之间核苷酸同源性为90.3％-99.5％;与欧洲型代表株LV株、美洲型代表株ATCC VR-2332株、中国代表株CH-1a株和中国HP-PRRS代表株JXA1株核苷酸同源性分别为61.2％-62.2％、88.6％-89.2％、92.5％-95.8％和90.5％-99.2％;与中国猪养殖场常用的几种弱毒疫苗株核苷酸同源性为87.8％-99.6％;与美洲型毒株和欧洲型毒株氨基酸同源性为80.3％-99.2％和53.5％-55.1％;本研究的5株南疆PRRSV均属于美洲型亚群Ⅱ毒株.利用南疆PRRSV分子流行病学调查结果,可为南疆PRRS防制疫苗的选择等做进一步的调整或指导奠定基础.     

CiWRKY17基因克隆与生物信息学分析

本研究主要目的是克隆中间锦鸡儿WRKY17转录因子并对其编码蛋白的理化性质及结构特征进行生物学特性分析.首先对CiWRKY17进行基因克隆,其次将PCR扩增后得到的全长连接到克隆载体上,最后利用生物信息学工具分析CiWRKY17等蛋白的生物学特性.结果 显示,CiW RKY17基因全长957 bp,编码318个氨基酸残...     

单核细胞增多性李斯特菌新疆分离株lmo0159基因克隆及生物信息学

采用PCR方法对lmo0159基因进行扩增、克隆及序列测定,通过应用在线EXPASTY Proteomic、SOSUI、SMART、SignalP、TMHMM、SOPMA及ProtFun等程序,同时结合DNAMAN和DNAStar生物信息学软件,对LM90SB2菌株lmo0159基因进行序列分析,并对其编码蛋白质的空间结构和功能预测。结果表明,分离株LM90SB2的lmo0159基因序列全长为2 070 bp,包含1 851 bp开放阅读框,共编码617个氨基酸;序列同源比对显示,LM90SB2菌株lmo0159基因核苷酸和氨基酸序列与4b型参考菌株同源性均较高,分别为99.1%～100.0%和99.7%～100.0%。系统进化树显示,LM90SB2菌株lmo0159基因核苷酸序列与LM3、LM9、LM11、LM12、F2365、LM188、NSTN、H34、hs2008、LL195和2306等菌株聚为同一支,说明它们的亲缘关系比较近。lmo0159蛋白质是一种偏酸性、稳定、亲水性蛋白质,其二级结构是混合型,其中无规则卷曲最多,无跨膜区域,无信号肽区域,但含有1个胶原蛋白结合域和3个Cna B结构域。功能分析显示,lmo0159蛋白质在氨基酸生物合成、酶代谢、脂肪酸代谢、免疫应答和胁迫应答等方面的几率均较高。本研究成功克隆LM90SB2 lmo0159基因,为进一步研究LM90SB2的lmo0159基因功能提供了帮助。     

陆川猪FAM134B基因克隆及生物信息学分析

本试验旨在对陆川猪FAM134B基因进行克隆及生物信息学分析。本研究利用Gen Bank公布的猪序列设计引物,应用RT-PCR扩增得到目的基因片段,应用生物信息学方法分析和预测了陆川猪FAM134B基因的理化性质与二级结构。结果显示:陆川猪FAM134B基因编码区全长1 107 bp,编码368个氨基酸;陆川猪FAM134B基因与与金华猪(JX854456.1)、牛(KM587693.1)、山羊(KF684947.1)、人(NM_001034850.2)、小鼠(NM_001034851.2)、大鼠(NM_001034912.1)、非洲爪蟾(NM_001126975.1)序列相似性分别为87.80%、87.44%、86.9%、68.47%、67.01%、67.29%、61.44%,结合系统进化树分析,结果表明不同物种FAM134B基因在进化过程中具有高度保守性。通过比较分析发现,陆川猪FAM134B基因CDS序列区比NCBI公布的金华猪FAM134B序列(JX854456.1)多了一段129 bp序列,比预测的猪FAM134B序列(XM_003483804.2)少了一段371 bp,这提示所扩增得到的陆川猪FAM134B基因有可能是另外一种剪接体。本研究成功克隆陆川猪FAM134B基因完整的CDS序列,为今后FAM134B基因在陆川猪的脂肪沉积及脂肪代谢方面的研究提供基础理论。     

湖南沙子岭猪SLA-DR基因克隆及生物信息学分析

为了克隆湖南沙子岭猪SLA-DRA和SLA-DRB基因, 分析SLA基因特性和抗原多态性, 评价湖南沙子岭猪在异种移植中的应用前景奠定基础。应用RT-PCR分别扩增湖南沙子岭猪SLA-DRA和SLA-DRB基因, 鉴定后克隆到PUCm-T载体并进行测序, 用NCBI中的BLAST和ExPASY中相关软件进行生物信息学分析。得到的湖南沙子岭猪SLA-DRA 和SLA-DRB 基因特异性基因片段, 大小分别为1 177 bp和909 bp。生物信息学分析发现, 所扩增的SLA-DRA 和SLA-DRB 基因片段均包含完整的开放阅读框, 分别编码252和266个氨基酸残基。将湖南沙子岭猪SLA-DRA和SLA-DRB基因在GenBank 登录, 登录号分别为EF143987和EF143988。同源性分析发现, 湖南沙子岭猪SLA-DRA 和SLA-DRB 与人类相应的DRA、DRB相比, 核苷酸序列同源性分别为83% 和83 %, 编码氨基酸同源性分别为83% 和79%。与GenBank 登录的其他猪种相比, SLA-DRA基因同源性最高可达100 %, 而SLA-DRB基因具有多态性。     

兴义鸭MEF2A基因克隆及生物信息学分析

为了获取鸭MEF2A基因完整编码区(CDS)序列,进一步揭示其遗传机理。本试验采用兴义鸭为研究对象,采用RT-PCR方法克隆获取MEF2A基因CDS区序列,经重组质粒测序、拼接,试验初步获得了兴义鸭MEF2A基因完整编码区序列,得到1 479 bp片段,包含起始密码子和终止密码子,编码492个氨基酸,表达蛋白分子量为53.14 k D。经序列对比,在G~(429)A、T~(661)A、A~(1423)G、A~(1426)G和G~(1467)A分别发生了单核苷酸突变,其中T~(661)A和A~(1423)G突变分别导致Cys(半胱氨酸)到Ser(丝氨酸)、Glu(谷氨酸)到Lys(赖氨酸)的改变,其他位点均属于同义突变。试验对兴义鸭MEF2A蛋白的理化性质及结构特点进行了简单分析,为下一步研究MEF2A蛋白特性及其作用机制奠定理论基础。     

番茄COBRA基因克隆、表达模式及生物信息学分析

COBRA作为一种重要的胞外糖基磷脂酰肌醇(GP-I)锚定蛋白,影响植物细胞壁中纤维素含量及细胞的定向伸长。目前已有多个拟南芥、玉米及水稻的COBRA基因的突变体被研究。而有关番茄COBRA基因克隆的研究尚未见报道。本研究利用RT-PCR技术克隆了一个假定编码番茄COBRA蛋白的SlCOBRA基因,并在GenBank注册(JN398667)。序列测定和分析表明,该序列由6个外显子组成,编码444个氨基酸残基;氨基酸序列中存在COBRA蛋白的CCVS保守基序,N端的跨膜信号肽及C-末端的疏水性尾部和GPI锚定ω-位点。系统进化分析表明番茄SlCOBRA与拟南芥AtCOB具有80%氨基酸序列同源性,聚在一个分支上。Real-time PCR分析番茄各个组织中COBRA基因的表达结果表明番茄COBRA为组成型表达,在营养器官(根、茎、叶)中的表达量高于花和果实,尤其在成熟的果实中(从转色期到红熟期)表达量明显减少。     

羊流产嗜衣原体ompA基因克隆及生物信息学分析

分析羊流产嗜衣原体ompA基因结构并预测其编码蛋白的结构和功能。采用DNA Star、DNA MAN、vector NTI suite11.5序列分析软件和在线网站ExPASy分析该基因的结构和预测其编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、一级结构修饰位点、二级结构特征及三维空间构象、潜在抗原表位等。结果显示,该基因全长1 170 bp,可编码389个氨基酸,编码蛋白理化性质较稳定,无各种亚细胞定位序列,含有多个能被其他酶修饰的位点,该蛋白以无规则卷曲为主,大部分氨基酸残基包埋在分子内部,含5个跨膜区,3个亲水性较强的抗原表位。ompA基因生物信息学分析结果为ompA蛋白功能的深入研究和新型多价疫苗的开发提供了基础数据。