中国白块菌-攀枝花块菌子囊果内可培养细菌的多样性研究

对新近发现的块菌属一新种-攀枝花白块菌（Tuber panzhihuanense）子囊果中可培养细菌的多样性进行了研究。采用胰蛋白大豆培养基（TSA）对菌株进行分离。用毛细管电泳（HPCE）对所有获得的菌株的16SrDNAV3高变区进行筛选获得不同条带大小的菌株,对筛选出的菌株的16SrDNA进行测序．并进行细菌多样性分析和研究。结果显示,攀枝花块菌子囊果内可培养细菌在数量及种类上都表现出很高的多样性,所有细菌分属于5个门的11个属和20个种。在所分离到的变形菌门的细菌中,数量最多的菌株（49．68％）属于γ-Proteobacteria,其中假单胞菌属的Pseudomonas lurida为优势类群;其次为d．Pro．teobacteria,占37．42％,其中以固氮菌Bradyrhizobium japonicum和Phyllobacteriumspp．为优势类群。其余的菌株属于放线菌门（Actinobacteria）（3．22％）和厚壁菌门（Firmicutes）（7．74％）,厚壁菌门中以芽孢杆菌属（Bacillus）为代表菌群。酸杆菌门中的Terriglobus roseus（1．94％）首次从块菌中分离获得。     

用传统分离培养法和高通量测序技术分析印度块菌子囊果内细菌的群落结构

块菌是重要的经济真菌, 在其生长发育过程中, 细菌扮演了重要角色。本文利用传统分离培养方法和高通量测序技术分析了印度块菌(Tuber indicum)子囊果内细菌的群落结构。共分离得到细菌532株, 根据物种累积曲线, 选取其中的112株细菌进行了16S rRNA基因序列分析, 共鉴定出4属40种, 其中假单胞菌属(Pseudomonas)菌株占所测菌株数的80%, 不动杆菌属(Acinetobacter)占12.5%, 链霉菌属(Streptomyces)占5%, 贪噬菌属(Variovorax)占2.5%。通过对印度块菌子囊果16S rRNA基因的V1-V3区高通量测序分析, 共获得细菌序列9,862条, 分属于7门43属220种, 其中变形菌门、拟杆菌门和放线菌门的物种占总物种数的99.7%, 是印度块菌子囊果内的优势细菌。黄杆菌属(Flavobacterium)、壤霉菌属(Agromyces)、微杆菌属(Microbacterium)、剑菌属(Ensifer)和寡养食单胞菌属(Stenotrophomonas)的物种数占总物种的86.3%, 是印度块菌子囊果内细菌的优势属。研究结果表明, 采用胰蛋白大豆培养基仅分离得到印度块菌子囊果内少数细菌物种, 而采用高通量测序技术分析发现, 印度块菌子囊果内细菌物种种类丰富, 群落结构复杂。     

蕙兰根内可培养细菌的物种多样性

以MS基本培养基添加蕙兰菌根浸出液制成的培养基进行分离培养的方法,从野生蕙兰（Cymbidium faberi）根部首次分离到内生细菌。经过分离纯化培养获得纯菌株27株。经过16S rDNA基因序列测序,并与GenBank数据比对,其相似性均在98%以上,分析鉴定结果表明,存活的22株菌可分为8属14种。分别隶属于伯克氏菌属（Burkholderia）、假单胞菌属（Pseudomonas）、芽胞杆菌属（Bacillus）、Leifsonia属、贪食菌属（Variovorax）、欧文氏菌属（Erwinia）、Duganella属和不动杆菌属（Acinetobacter）。对这些菌株进行分离培养及鉴定有助于理解兰花与微生物之间的相互作用关系,为开发利用这些微生物开辟新的思路。     

印度块菌子囊果内部解剖结构的扫描电镜观察

利用扫描电镜对成熟印度块菌子囊果的内部结构进行了观察,以系统揭示其子囊果内部组织特征,为块菌属的分类以及块菌属真菌子囊果的生理研究奠定基础。观察结果进一步证明,成熟印度块菌子囊果横切面上的白色迷宫状脉络是由不育的侧丝构成,而暗脉则是被侧丝缠绕并包裹着的可育的菌丝组织,即产孢组织,这些白色脉络和暗脉就构成了印度块菌子囊果横切面上迷宫状的纹脉;产孢组织中,可观察到正在发育的大大小小的子囊被缠绕在一起的大量产囊丝与侧丝包裹着,形成密密麻麻微小的类似蜂巢状结构;子囊孢子游离于子囊中,成熟子囊孢子表面有刺状纹饰,刺的顶端有小弯钩。单个子囊内含的子囊孢子大小与其内含的子囊孢子数目有关,子囊内所含的子囊孢子越多,子囊孢子就越小。     

昆明地区印度块菌子囊果的解剖结构研究

通过印度块菌子囊果石蜡切片的显微观察,对印度块菌子囊果包被及子实层的显微结构、子囊及子囊孢子的发育过程进行研究.结果表明:(1)印度块菌子囊果是由包被和子实层构成,子囊果的表面密被大量大小不一的疣状突起,包被由外皮层和内皮层构成;子实层由封闭的、大小不一的产孢组织构成,在产孢组织中包含有侧丝、产囊丝、子囊和子囊内的子囊孢子;(2)成熟印度块菌子囊果横切面上有明暗相间的迷宫状纹脉;(3)子囊卵形,由产囊丝顶端的细胞发育而来;(4)成熟子囊孢子红褐色,椭圆形至近球形不等,子囊孢子双层壁,外壁密布有刺状纹饰.子囊孢子在子囊内的发育过程中常出现败育现象,每个成熟子囊中含有1～5个子囊孢子(常见4个).     

Ugan古河道胡杨可培养内生细菌的多样性

摘要：【目的】为了了解塔河废弃古河道胡杨可培养内生细菌的多样性。【方法】从2棵胡杨树干部抽出其内存液,采用三种不同的培养基对样品的内生细菌进行了分离纯化;对它们进行16S rDNA测定和系统进化分析。【结果】分离纯化不同表型的细菌62株,对它们的16S rDNA序列分析表明,62株菌分别属于四个大类群;厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门(Actinobacteria)、α-变形菌纲(Alpha Proteobacteria) 、γ-变形菌纲(Gamma Proteobacteria),18个属,32个种;芽孢杆菌属和假单胞菌属是胡杨可培养内生细菌的优势细菌种群,它们分别占已测种群的40.32%、16.13%。其中菌株KTH-63为葡萄球菌科的潜在的新属新种,它与最近源菌株的16S rDNA序列相似率为92.491%;9株菌KLH-21、KLH-1、KTH-8、KTH-14、KNA-26、KLH-18、KTH-20、KNA-3、KLH-25是潜在的新种（16S rDNA相似率为96.089 %-97.769 %）,胡杨树干内存液中潜在新种的发现率高达总分离检测菌株的16.13 % 。本研究获得的胡杨可培养内生细菌的群落结构数据给植物内生细菌新增了10个属,18个种。【结论】胡杨具有多样性极其丰富的可培养内生细菌菌种资源,土著新种的发现频率超出了预期,胡杨可培养内生细菌的群落结构极大地刷新了植物内生细菌的种群记录,极具进一步发掘的潜力。     

玉溪地区自然陈化烟叶表面可培养细菌多样性研究

目的 为了较全面的了解陈化烟叶的细菌多样性,进一步挖掘其中的有益微生物。方法 以种植于玉溪元江县的红大烤烟品种为材料,利用16S rDNA克隆测序技术,系统研究了云南玉溪红塔区和元江县两仓库中不同自然陈化时期烟叶表面可培养微生物的种群结构。 结果 陈化初期,烟叶表面细菌数量较少,元江县低水分烟叶陈化30 d时细菌数量达到高峰;红塔区高水分烟叶陈化4.5个月时细菌数量达最大;经过16S rDNA鉴定,烤烟叶面细菌包括芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、肠杆菌属（Enterobacter sp.）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus sp.）和泛菌属（Pantoea sp.）等8个细菌属。结论 不同时期、不同地点陈化烟叶表面细菌的优势种群不尽相同,而芽孢杆菌属始终为优势种群。另外,研究中分离到的大量可培养细菌,为进一步筛选烟叶表面有益细菌提供了重要线索。     

中国地下子囊菌新记录属——史蒂芬块菌属

文中首次报道了史蒂芬块菌属Stephensia在中国的分布.史蒂芬块菌发现于滇中地区呈贡县,生于l株栽培的天麻旁边,附近长有云南松和榛属植物.标本的特征与文献中对于该种的描述一致,即子囊果表面具褐色绒毛,产孢组织有曲折的脉沟,脉沟向中心辐聚,中心有时形成空腔,孢子球形,直径18～25 μm,无油滴,包被(外囊盘被)角胞组织.中国标本的ITS序列与北美和欧洲样品有99％的相似性,其LSU序列仅有3个碱基与北美样品不同.史蒂芬块菌在分子系统上与腔囊块菌属Hydnocystis和地杯菌属Geopxyis近缘.     

四川攀枝花地区印度块菌菌根根际土壤内可培养放线菌功能多样性

以四川攀枝花地区印度块菌菌根根际土壤为对象, 利用4种放线菌分离培养基筛选其中的放线菌, 采用基于16S rRNA 基因的PCR-RFLP方法结合传统的形态学观察进行鉴定。通过测定各分离菌株摇瓶培养发酵液中酶活性或代谢产物获取各菌株降解碳水化合物以及产促生剂的能力, 采用平板对峙法测定各菌株抗病原真菌活性。结果共分离得到125株放线菌, 经形态学观察去重复得到57株(W1-W57), 经多样性分析将其归于3个属的23个种, 其中以链霉菌属最多(91.3%), 功能分析表明: 有23株、17株、15株和18株放线菌能分别降解1,3-β-葡聚糖、几丁质、纤维素和果胶, 其中有47.8%、26.1%和26.1%的菌株能同时降解4、3和2类碳水化合物; 有19株、3株和2株放线菌分别能产含铁载体、IAA和ACC脱氨酶, 其中有21.7%、56.6%和21.7%的菌株能分别产生3、2和1种根际促生剂; 有10株放线菌表现出对不止一种病源真菌的拮抗能力, 其中菌株W2和W19对4种病源真菌同时具有拮抗活性, 且这2株菌对4种病源真菌抑菌能力比其他菌强; 同时获得了包括W2、W3、W17、W19、W20、W34、W36和W54等在内的多功能高活性菌株, 该研究表明四川攀枝花地区印度块菌菌根土壤内含丰富的多功能放线菌。所获结果可为我国印度块菌人工种植新技术的开发提供新思路。     

东海表层沉积物纯培养与非培养细菌多样性

于2011年7月采集了浙江舟山沿岸海底沉积物样品(122°10′41″E,29°49′7″N),通过埋片原位观察、荧光显微计数、纯培养菌分离以及非培养细菌构建克隆文库的方法,分析和研究了东海表层沉积物细菌群落结构及其多样性.埋片原位观察和荧光显微计数法的结果表明:沉积物样品中细菌的细胞数量为(9.30±3.44)×107 cells/g;通过分离纯化共获得313株细菌,分属于20个属,4种培养基对细菌的分离效果依次为RO＞M l＞Zobell 2216＞MR2A;常规形态学与生理生化鉴定结果显示芽孢杆菌属(Bacillus)和海球菌属(Marinococcus)从数量和种类上皆为优势菌属,分别占分离菌株总数的21.08％和17.25％;对73株典型海洋细菌进行16S rDNA分子鉴定发现,厚壁菌门(57.5％)、γ-变形杆菌纲(32.9％)、黄杆菌纲(4.1％)和放线菌纲(5.5％)等为主要类群.非培养细菌克隆文库序列分析发现:细菌克隆子主要属于厚壁菌门和变形杆菌门,而芽孢杆菌纲和γ-变形杆菌纲是上述两个门的优势类群.综合纯培养与非培养数据得出东海海域表层沉积物细菌多样性丰富,具有进一步开发研究的价值.     

Diversity of Culturable Bacteria Associated with Tuber panzhihuanense Pinus armandii Ectomycorrhizosphere Soil

Truffles are edible hypogeous ectomycorrhizal fungi which have great economic importance for their organoleptic properties and have significant ecological interests for forestry. Although some new precious Chinese white truffle have been described constantly, the molecular mechanisms that control truffle body formation are largely unknown. It has been hypothesized that ectomycorrhizosphere soil communities may have influences on truffle production. Thus, isolation and molecular characterisation of culturable bacteria were carried out to investigate the bacteria diversity in mycorrhizosphere soil of Tuber panzhihuanense Pinus armandii in this work. Sequencing results showed a significant presence mostly affiliated with Burkholderia was β Proteobacteria (3098%). The second culturable fraction which dominated by Pseudomonas was γ Proteobacteria (288%) other isolates were mostly Phyllobacterium and Rhizobium, members of α Proteobacteria (1467%), actinobacteria (125%) and Firmicutes (76%) represented by Arthrobacter and Bacillus, respectively. Chryseobacterium ureilyticum was the only bacterial strain belonging to Bacteroidetes. Similarities and differences of culturable bacterial community of ascocarps and ectomycorrhizosphere soil associated with Tuber were discussed.     

黄海繁茂膜海绵中微生物多样性的研究

构建了中国黄海繁茂膜海绵中细菌16S rDNA克隆,对其遗传多样性进行了分析,发现海绵中相关细菌16S rDNA基因主要归类于紫硫细菌门(Proteobacteria)中的α-亚门、γ-亚门,和放线菌门(Actinobacteria)等类群。所获得的16S rDNA序列与GenBank中的已知序列差异较大,反映出该海绵存在尚未发现的微生物新信息。     

海绵Pachychalina sp.体内细菌多样性的研究

通过非分离培养分析方法,直接从海绵体内提取细菌总DNA。以样品总DNA为模板进行PCR扩增获得细菌16S rDNA。用16S rDNA限制性酶切片段长度多态性(ARDRA)和测序方法对南海湛江海域海绵Pachychalina sp．体内的细菌多样性进行了研究。在细菌16S rDNA的ARDRA图谱中,大多数克隆的酶切带谱间存在差异;随机挑选22个克隆进行测序得到它们的16S rDNA部分序列,大部分序列属于γ-proteobacterium和α-proteobacterium,但有少数克隆序列与RDP数据库中收录的16S rDNA序列间的相似性极小,不参与系统发育树的构建。研究结果表明海绵Pachychalina sp.体内细菌组成具有丰富的多样性。     

宁夏黄土高原马铃薯连作栽培对土壤可培养细菌遗传多样性的影响

采用平板培养、BOXAIR-PCR和16S rDNA RFLP技术对宁夏黄土高原马铃薯连作栽培土壤可培养细菌遗传多样性进行研究。结果表明,4个连作年限2个生育期8份土样共分离到91株细菌菌株, BOXAIR-PCR分析发现,91株细菌菌株的遗传相似系数为0.531～0.939,相同连作年限不同生育期根际土细菌菌群分布不同,不同连作年限同一生育期根际土细菌菌群的分布也不同,随着连作年限增加,可培养细菌遗传多样性呈现下降趋势;结合16S rDNA 的序列分析,从91株菌株中筛选出的41个代表菌株可分为23个物种,分属于细菌域的12个属,其中,芽孢杆菌属（Bacillus）占同一连作年限菌株数的53.6%。连作导致土壤细菌菌群结构发生变化,出现各自特有的菌属。系统发育分析表明,23个细菌物种分布于6个系统发育群。     

一株甲烷利用菌的分离、鉴定和性能研究

目的：研究土壤中能利用甲烷的细菌类型及特性。方法：运用传统的富集、分离、纯化方法得到1株甲烷利用菌,结果：该菌株在显微镜下呈球形,在液体培养基中生长72h后OD值可达到0.8左右,其最适生长温度30℃,最佳pH值7左右。对该菌株进行了16SrDNA扩增,测序结果表明其与Pseudoxanthomonas菌属的序列相似性为93%,其生理生化特征和分子鉴定结果表明,该菌与假黄单胞菌为不同的属。甲烷消耗气相色谱分析结论显示,120h后培养瓶中的甲烷浓度降低60%左右,说明该菌株具有较好的利用甲烷的性能。     

一株石油烃降解菌分子鉴定及特性分析

从受污海水中分离筛选了具有石油烃降解能力的降解菌Bac1020,经PCR扩增得到1 497 bp长16S rDNA序列,通过Blast比对,与主要石油烃降解菌属16S rDNA序列构建系统发生树,鉴定其为不动杆菌(Acinetobactersp.)。降解菌(Acinetobactersp.)在72 h内生长稳定,对石油烃的降解率随时间的延长而不断增加。建立了快速筛选及鉴定石油烃降解菌的方法,应用于海洋石油烃污染的生物降解。     

滑桃树不同器官伴生细菌多样性的分子特征

应用不依赖于培养的16S rRNA基因技术,揭示滑桃树根皮、茎皮以及种子伴生细菌的种类多样性,为建立伴生细菌的宏基因组文库奠定基础。基于我们新近发表的植物伴生菌富集方法,建立富集和未富集样品的全长16S rRNA基因文库,随机挑取至少100个克隆进行酶切分型并测序,根据16S rDNA的部分序列推测其所属伴生菌的种类。结果表明,所检测的细菌克隆大部分属于γ-Proteobacteria,有少量来源于α-Proteobacteria或放线菌（Actinobacteria）,也包括不可培养或分类地位不明确的细菌。经过富集,16S rRNA基因文库中细菌克隆的比例和序列多样性显著增加,根皮的伴生细菌种类最为丰富,其次是成熟种子和茎皮;幼嫩种子16S rDNA文库的细菌克隆比例较小（1．18％）,说明幼嫩种子的伴生菌最少。     

一株产纤维素酶细菌的筛选、鉴定及产酶条件优化

目的：筛选1株产纤维素酶的细菌。方法：通过对从腐烂朽木及其附近土壤中得到的样品进行富集培养、分离纯化得到16株纤维素分解菌,经刚果红染色鉴定和液体发酵培养后对其进行了菌种初步鉴定及产酶条件的初步优化。结果：获得1株纤维素酶分泌量较高的细菌LT3。结论：LT3为革兰氏阳性菌,菌体成杆状,经发酵优化培养后,较适产酶条件为甘蔗渣20g/L,pH7.0、30℃培养120h,CMC酶活为71.17U/mL,滤纸酶活为33.37U/mL。通过克隆其16S rDNA序列,对其进行系统进化分析,鉴定为蜡状芽孢杆菌。