免疫荧光法检测原核和真核细胞中表达的轮状病毒外壳蛋白VP4

目的：用免疫荧光法快速检测原核和真核细胞中表达的轮状病毒（RV）外壳蛋白VP4。方法：以抗VP4的抗体为一抗、FITC标记的羊抗豚鼠IgG为二抗,用免疫荧光方法检测在大肠杆菌BL21（DE3）中重组表达的同源RVVP4;检测SA11或Wa株RV感染MA104细胞后不同时间段病毒VP4的合成及其在感染细胞中的分布情况。结果：用免疫荧光法可直接检测到原核细胞中表达的外源蛋白,也可检测到病毒蛋白在真核细胞中的分布情况。结论：免疫荧光法可特异、方便、快速地检测RV VP4在原核和真核细胞中的表达;来源于RV TB—Chen株的VP4抗体可特异性识别同源病毒VP4,交叉识别SA11或Wa株的VP4。     

轮状病毒RNA基因图谱变异分析

用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对轮状病毒(RV)标准株进行RNA基因图谱分析,发现人轮状病毒(HRV)Wa株在MA104细胞上连续传5代后,其RNA基因图谱由原来的4:2:3:2模式变为4:3:3:2模式。继续分别在CV-1、MA104细胞上传代后,基因图谱进一步演变为4:3:4:2模式。经比较电泳、病毒空斑纯化,初步证实RVWa有变异林存在。目前尚未见RV标准株变异的报告,有待进一步研究。同时对多个RV标准株及1939年南京市区婴幼儿秋季腹泻的RV流行株进行基因图谱分析,发现不同的人RV及牛RV标准株有相同的基因图谱;不同实验室来源的同一标准株有不同的基因图谱。此外,尚证实HRV是1989年南京市区婴幼儿秋季腹泻的主要病源,总检出率45.1％,电泳长型为流行优势株89.2％。本文尚对RV RNA基因图谱变异的原因及意义进行了讨论。     

A组轮状病毒NSP1基因克隆表达及免疫学性质研究

轮状病毒（rotavirus, RV）非结构蛋白1（non structural protein 1, NSP1）在病毒与宿主的相互作用中发挥着重要的功能。运用基因克隆和表达技术在大肠杆菌中表达了TB-Chen株RV NSP1蛋白,进行了NSP1的免疫学性质和RV感染细胞中NSP1蛋白的合成与分布以及NSP1的系统进化和基因分型研究。结果表明,大肠杆菌BL21(DE3)能高效表达重组NSP1蛋白（rNSP1）,rNSP1表达量约占菌体总蛋白的34.4%。rNSP1能诱导免疫豚鼠产生特异性血清抗体。Western blot及免疫荧光检测结果表明,抗rNSP1血清抗体能特异性识别自身蛋白,对SA11、Wa株的NSP1蛋白有交叉反应性;免疫荧光结果还表明,SA11感染的MA104细胞中合成的NSP1蛋白在细胞质中区域化聚集形成辐射状排列的颗粒状结构,而Wa株的NSP1不能形成此样结构。至今发现的A组RV至少可以分为16个不同的NSP1基因型,TB-Chen株NSP1为A2型。不同基因型有独特的敏感宿主范围,同一基因型可能感染不同种动物,同一种动物也可能感染不同基因型。基因型A4型和A16型仅在鸟类病毒株中出现;而且鸟类中只有A4型和A16型。研究结果为进一步研究NSP1蛋白质的结构功能及其应用开发奠定了很好的基础。     

轮状病毒生物学性状的研究

对最常应用的3个轮状病毒(RV)标准株(人的Wa株,牛的NCDV株,猴的SA_(11)株)进行了形态学、培养特性及理化性质的比较观察与检测。它们在MA_(104)细胞上的培养特性基本相同,在电镜下呈现RV特有的形态结构,RNA电泳图具有典型的电泳带分布模式4、2、3、2规律,各项理化性质亦与文献报道一致。表明RV的细胞适应株的生物学性状有相当高的稳定性。     

A组轮状病毒NSP6蛋白表达及免疫学性质研究

轮状病毒(RV）NSP6与NSP5由同一基因片段编码,至今对NSP6 性质了解很少。用基因重组表达和免疫学方法,重组表达了A组人RV NSP6蛋白,进行了NSP6的动物免疫及其抗原反应性、免疫原性研究以及RV感染细胞中NSP6的合成及亚细胞分布研究。研究结果表明,NSP6可在原核系统中高效表达,表达蛋白占菌体总蛋白的34.2%;NSP6免疫豚鼠血清抗体可特异性识别菌体细胞中表达的NSP6和SA11及Wa病毒感染的MA104细胞中合成的NSP6蛋白;病毒感染细胞中合成的NSP6在感染后3h就可检测到,12h表达量达到最高;NSP6在病毒感染细胞质中呈弥散状分布,并主要积聚在细胞核的周围,未观察到毒质体样结构。研究结果对深入了解RV NSP6的结构与功能具有重要的意义,具有重要的潜在应用价值。     

被动免疫轮状病毒NSP4&VP7双抗原重组腺病毒对感染乳鼠的排毒保护作用

为建立小鼠轮状病毒(Rotavirus,RV)感染动物模型,研究可同时表达轮状病毒NSP4 (Nonstructural protein 4)和VP7(Viral protein 7)的重组腺病毒疫苗免疫孕鼠后对新生乳鼠感染RV的被动保护作用.新生乳鼠口服异源株轮状病毒Wa、ZTR-68或SA11株后(分2次给予,每次含5×104 CCID50的RV),观察乳鼠是否有腹泻症状、肠道病理变化,检测乳鼠粪便排毒百分率;另以重组腺病毒rAd-NSP4-VP7免疫孕鼠后,检测母鼠血清抗体产生情况,并对比乳鼠粪便中RV抗原检出率初步评价疫苗的被动免疫保护作用.发现口服异源株RV的乳鼠未出现类似人类婴幼儿感染后的明显腹泻症状,但在粪便中可检测到RV抗原的存在(Wa、ZTR-68攻毒组均超过80％).经rAd-NSP4-VP7被动免疫的乳鼠接受Wa和ZTR-68攻毒后其粪便中的RV检出率比未受到被动免疫保护的对照组降低(P＜0.05).rAd-NSP4-VP7重组腺病毒免疫母鼠可显示出对孕鼠感染RV的被动免疫保护作用.     

轮状病毒VP4抗原表位在VP6载体蛋白同一位点表达比较研究

目的:评价轮状病毒(RV)VP4两个抗原表位插入VP6载体蛋白同一位点所表达的重组嵌合蛋白免疫学性质及在研制嵌合蛋白疫苗中的意义。方法:采用分子克隆和基因重组技术将RV VP4的两个抗原表位插入到VP6载体蛋白同一位点上,构建重组抗原表达质粒,表达携带不同抗原表位的重组嵌合蛋白,用Western blot和中和试验分析重组嵌合蛋白的抗原反应性和免疫原性。结果:成功构建了两个嵌合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达;表达的嵌合蛋白可与相应抗体特异性反应;可诱导豚鼠产生特异性血清抗体;抗嵌合蛋白血清抗体可特异性识别载体蛋白VP6F,Wa株病毒的VP6和VP4蛋白,可中和Wa株病毒在MA104细胞上的感染性;结果表明,所构建和表达的两个以VP6为载体的VP4抗原表位嵌合蛋白具有较高抗原反应性和免疫原性;嵌合蛋白携带的VP4抗原表位具有增强载体蛋白免疫原性作用;为研制新型RV重组蛋白疫苗的奠定了较好的基础。     

秋泻灵和儿泻停颗粒在体外传代细胞上抗轮状病毒的研究

目的:研究比较中药制剂秋泻灵和儿泻停颗粒体外传代细胞上抗轮状病毒的作用,为秋泻灵的进一步动物试验及临床应用提供一定的实验依据。方法:颗粒状药物用PBS溶解过滤后作为原液,稀释至不同浓度,用于以下实验:1不同浓度的药物直接于4℃与SA11轮状病毒作用1 h后,接种到轮状病毒敏感的恒河猴肾细胞MA104上,评估药物对病毒的灭活作用;2用不同浓度的药物作用细胞1 h,再接种SA11,评估药物阻止病毒入侵细胞的作用;3先用轮状病毒SA11株感染MA104细胞,然后测定不同浓度的药物抑制病毒增殖的作用。结果:秋泻灵和儿泻停的半数细胞毒性浓度(CC50)分别为3.62和2.60 mg/m L;药物浓度为1×10~(-4)~10 mg/m L时,二者对轮状病毒有灭活作用;在阻止病毒入侵细胞的实验中,儿泻停在较高浓度时有效,而秋泻灵在低浓度时有效;在清除已感染MA104细胞的SA11轮状病毒时,二者在适宜浓度时有微弱作用。结论:秋泻灵和儿泻停在适宜浓度时对轮状病毒SA11有灭活作用;二者对阻止SA11轮状病毒入侵MA104细胞显示了一定的的保护作用;本次试验条件下,二者在一定浓度下显示了清除已感染MA104细胞的SA11轮状病毒的微弱作用。     

轮状病毒感染成年小鼠的研究

目的研究成年昆明种小鼠对实验感染人轮状病毒(rotavirus,RV)的敏感性。方法在实验条件下,用A组人Wa和恒河猴SA11株RV感染成年昆明种小鼠,观察小鼠的临床反应和排毒情况。结果成年昆明种小鼠感染Wa和SA11RV第二天后出现明显的临床腹泻症状,第四天达到高峰;至少在感染后连续6天的动物大便中可检测到较高滴度的RV抗原。结论成年昆明种小鼠对RV感染有很高的敏感性,可做为动物模型,在RV感染的药物治疗效果评价和疫苗保护性效果评价中具有重要价值。     

A组轮状病毒VP5*和VP8*的表达和免疫学性质研究

轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的主要病原,VP4是RV重要的抗原蛋白,在早期病毒与细胞黏附过程中发挥重要作用,包括受体结合和细胞渗透。在细胞黏附过程中,VP4易被切割成VP5*和VP8*两个片段并以此增强病毒感染性。为了深入研究VP5*和VP8*的免疫学性质,进一步评价其应用前景,本研究从TB-Chen株RV基因组中编码VP4蛋白基因上克隆了VP5*和VP8*开放读码框核苷酸序列,构建了表达质粒,在原核大肠杆菌系统中重组表达了VP5*和VP8*蛋白,进一步分析了它们的免疫学性质。结果显示,VP5*和VP8*可在E.coli中高效表达,重组蛋白VP5* (rVP5*)和VP8* (rVP8*)可诱导免疫豚鼠产生特异性血清抗体,这些抗体可特异性识别自身蛋白（rVP5*或rVP8*）,可识别来自的TB-Chen株重组VP4蛋白,并可识别SA11和Wa感染的MA104细胞中合成的病毒VP4蛋白。这些结果表明,rVP5*和rVP8*蛋白具有较高的免疫原性,抗rVP5*和抗rVP8*的抗体具有高度特异性和交叉反应性。     

Recent advances in the study of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and pathogenesis

It has now been over twenty years since a novel herpesviral genome was identified in Kaposi's sarcoma biopsies. Since then, the cumulative research effort by molecular biologists, virologists, clinicians, and epidemiologists alike has led to the extensive characterization of this tumor virus, Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus(KSHV; also known as human herpesvirus 8(HHV-8)), and its associated diseases. Here we review the current knowledge of KSHV biology and pathogenesis, with a particular emphasis on new and exciting advances in the field of epigenetics. We also discuss the development and practicality of various cell culture and animal model systems to study KSHV replication and pathogenesis.     

A Unique Protease Cleavage Site Predicted in the Spike Protein of the Novel Pneumonia Coronavirus (2019-nCoV) Potentially Related to Viral Transmissibility

正Dear Editor,In December 2019, a novel human coronavirus caused an epidemic of severe pneumonia(Coronavirus Disease 2019,COVID-19) in Wuhan, Hubei, China(Wu et al. 2020; Zhu et al. 2020). So far, this virus has spread to all areas of China and even to other countries. The epidemic has caused 67,102 confirmed infections with 1526 fatal cases     

Curcuminoids as inhibitors of thioredoxin reductase: A receptor based pharmacophore study with distance mapping of the active site

Curcumin is the yellow pigment of turmeric that interacts irreversibly forming an adduct with thioredoxin reductase (TrxR), an enzyme responsible for redox control of cell and defence against oxidative stress. Docking at both the active sites of TrxR was performed to compare the potency of three naturally occurring curcuminoids, namely curcumin, demethoxy curcumin and bis-demethoxy curcumin. Results show that active sites of TrxR occur at the junction of E and F chains. Volume and area of both cavities is predicted. It has been concluded by distance mapping of the most active conformations that Se atom of catalytic residue SeCYS498, is at a distance of 3.56 from C13 of demethoxy curcumin at the E chain active site, whereas C13 carbon atom forms adduct with Se atom of SeCys 498. We report that at least one methoxy group in curcuminoids is necessary for interation with catalytic residues of thioredoxin. Pharmacophore of both active sites of the TrxR receptor for curcumin and demethoxy curcumin molecules has been drawn and proposed for design and synthesis of most probable potent antiproliferative synthetic drugs.     

Comparative morphology of the carpel in the Liliaceae: Hewardieae, Petrosavieae, and Tricyrteae

The young pistils in the melanthioid tribes, Hewardieae, Petrosavieae and Tricyrteae, are uniformly tricarpellate and syncarpous. They lack raphide idioblasts. All are multiovulate, with bitegmic ovules. The Petrosavieae are marked by the presence of septal glands and incomplete syncarpy. Tepals and stamens adhere to the ovary in the Hewardieae and the Petrosavieae but not in the Tricyrteae. Two vascular bundles occur in the stamens of the Hewartlieae and Tricyrtis latifolia. Ventral bundles in the upper part of the ovary of the Hewardieae are continuous with compound septal bundles and placental bundles in the lower part. Putative ventral bundles occur in the alternate position in the Tricyrteae and putative placental bundles in the opposite. position in the Petrosavieae. The dichtomously branched stigma in each carpel of the Tricyrteae is supplied by a bifurcated dorsal bundle.     

Synthesis and antimicrobial studies of hydrazone derivatives of 4-[3-(2,4-difluorophenyl)-4-formyl-1H-pyrazol-1-yl]benzoic acid and 4-[3-(3,4-difluorophenyl)-4-formyl-1H-pyrazol-1-yl]benzoic acid

Microbial resistance to antibiotics is an unresolved global concern, which needs urgent and coordinated action. One of the guidelines of the Centers for Disease Control and Preventions (CDC) to combat antibiotic resistance is the development of new antibiotics to treat drug-resistant bacteria. In our effort to find new antibiotics, we report the synthesis and antimicrobial studies of 30 new pyrazole derivatives. These novel molecules have been synthesized by using readily available starting materials and benign reaction conditions. Some of these molecules have shown activity with MIC values as low as 0.78?µg/mL against four bacterial strains; Staphylococcus aureus, methicillin-resistant S. aureus, Bacillus subtilis, and Acinetobacter baumannii. Furthermore, active molecules are non-toxic to mammalian cell line.