真核生物α-甘露糖苷酶生物信息学分析

α-甘露糖苷酶(α-mannosidase,α-Man)是真核生物蛋白质N-聚糖修饰的关键酶,其对甘露糖残基的修剪过程是糖蛋白N-糖链复杂化的必要步骤,对蛋白质的合成及正确构象的折叠起决定性作用。根据α-Man的功能特异性,其一般被分为糖基水解酶38家族(glycosyl hydrolase 38 family,GH38)、糖基水解酶47家族(glycosyl hydrolase 47 family,GH47)两个家族。利用生物信息学分析GH38家族与GH47家族在进化上的关系和氨基酸序列保守性以及不同物种内质网Ⅰ型甘露糖苷酶(endoplasmic reticulum ManⅠ,ERManⅠ)的理化性质、结构特点、功能特征后发现,GH47家族比GH38家族在进化上更早且保守性更好;α-Man基因在不同物种中长度存在明显差异,物种越高等基因平均长度越长;真核生物ERManⅠ均为亲水性不稳定蛋白质,其氨基酸序列存在跨膜螺旋并含有信号肽,且蛋白质空间构像为桶状,包含Ca~(2+)结合位点。文中对α-Man的生物信息学分析可以为研究α-Man在生命过程中的作用提供重要的信息。     

人溶酶体α-甘露糖苷酶cDNA的克隆与表达

溶酶体α-甘露糖苷酶是糖蛋白降解途径的主要外糖苷酶,该酶缺陷引起溶酶体α-甘露糖苷贮积症.用RT-PCR法从HeLa细胞中克隆的人溶酶体α-甘露糖苷酶cDNA含有1个由2964bp组成的阅读框,编码由988个氨基酸组成的多肽,前26个氨基酸为潜在的前导序列,成熟多肽的预测分子量为111kD,具有11个潜在的N-交联糖基化部位.用逆转录病毒介导法导入患者细胞后,该cDNA表达高活性α-甘露糖苷酶.序列分析表明,此cDNA与已发表的拟似人溶酶体α-甘露糖苷酶cDNA有不同程度的差异,尤其是第2315位碱基的T-C转换可能与控制酶活性有关     

甜瓜α-甘露糖苷酶亚家族基因的克隆及分析

在植物体中,α-甘露糖苷酶(α-man,α-mannosidase)是N-聚糖加工、修饰的关键酶,而N聚糖的加工对于植物生长发育是必不可少的,同时在果实成熟过程中起着重要作用。对甜瓜Ⅱ类α-甘露糖苷酶家族基因的结构特点和表达模式进行分析,为探讨α-甘露糖苷酶基因家族各成员在甜瓜不同组织器官发育中可能存在的作用奠定基础。本研究以甜瓜品种河套蜜瓜为材料,采用RT-PCR方法克隆了该家族的3个成员:Cm MAN1、Cm MAN2和Cm MAN3的全长c DNA,应用生物信息学方法对其相应蛋白质的理化性质、系统发育、保守基序进行了分析。分析研究表明,Cm MAN1、Cm MAN2和Cm MAN3的开放阅读框分别为3 063 bp、3 483 bp和3 024 bp,分别编码1 020、1 160和1 007个氨基酸,均为酸性蛋白质,且在不同物种间具有高度保守性。利用RT-q PCR方法检测了这些基因的表达模式,发现Cm MAN1在成熟甜瓜果实中表达量最高,Cm MAN2在叶、花和子房中表达量相对较高,Cm MAN3在子房中表达量较高,表明α-甘露糖苷酶各基因在甜瓜发育中可能具有不同的作用。     

微生物α-半乳糖苷酶的研究进展

α-半乳糖苷酶在多种生物内广泛存在,微生物是目前α-半乳糖苷酶的主要来源。微生物α-半乳糖苷酶可按照底物特异性或序列同源性分类,在古菌、细菌和真菌中均存在,其性质与来源和家族有关,催化机理大多为构型保留机制,目前主要应用于食品与饲料工业,还可用于生物质降解和医药领域。展望了微生物α-半乳糖苷酶的研究趋势。本文对相关研究者具有一定的参考意义。     

微生物源α-半乳糖苷酶的研究进展

介绍了微生物源α-半乳糖苷酶的生理生化特性、合成调控机制的研究进展情况及其在食品、饲料、医药工业等领域的一些应用。Α-半乳糖苷酶均是糖蛋白,不同来源的α-半乳糖苷酶的作用基质特异性差别较大,作用基质特异性差别是由蛋白质部分N-末端氨基酸序列决定的。不同微生物来源的α-半乳糖苷酶其最佳作用条件、pH稳定性及耐热性差异较大。微生物α-半乳糖苷酶是一种诱导酶,其合成受多个基因的调控,高浓度的葡萄糖能抑制其合成。     

α-半乳糖苷酶

最近各种媒体不断报道红血球类型可以通过酶处理进行转换 ,这对于输血和开拓血源有十分重要的意义 ,所用的酶是α 半乳糖苷酶。α 半乳糖苷酶 (α ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ,α Ｄ ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅｇａｌａｃｔｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ ,ＥＣ 3.2 .1 .2 2 )能专一地催化α 半乳糖苷键的水解。它广泛存在于各种植物和动物体内 ,许多微生物如双歧杆菌 (Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ)、黑曲霉菌 (Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ) [1] 、大肠杆菌 (Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ)Ｋ 1 2 1 [2 ]的抽提液中也发现有α 半乳糖苷酶的…     

棉花两个β-甘露糖苷酶cDNA的克隆及其特征

从陆地棉纤维cDNA文库中分离出两个B-甘露糖苷酶的cDNA克隆,GhManAl和GhManA2.它们的开放读码框编码长度分别为834个氨基酸和976个氨基酸的多肽序列,这两个多肽C-末端的747个氨基酸残基是完全一致的,而N-末端的序列差异较大.GhManAl和GhManA2均属于糖基水解酶家族2的成员,它们与其它植物来源的该家族中β-甘露糖苷酶之间具有较高的同源性,而与非植物来源的β-甘露糖苷酶之间的同源性较低,但不同蛋白序列中均存在糖基水解酶家族2的酶催化活性所需的两个Glu保守残基.这两个多肽的N-末端均没有信号肽序列,因此可能为胞内酶.从表达特征来看,GhManA1属于组成型表达基因,而GhManA2则为纤维细胞优势表达基因.     

β-半乳糖苷酶的研究进展

对β半乳糖苷酶的性质及作用机理作概述,同时对利用生物技术进行β半乳糖苷酶基因克隆和表达的研究概况进行了简要介绍。     

热稳定型α-半乳糖苷酶的应用及基因工程研究进展

α-半乳糖苷酶是一种水解酶,可以将食品、饲料中的不良寡糖等抗营养因子水解,改变其营养成分并被动物吸收利用。该酶广泛存在于植物、动物及微生物中,在饲料、食品等工业以及现代医学中都有应用。目前,开发热稳定的α-半乳糖苷酶并利用基因工程方法进行分子改造和外源表达已成为研究热点。本文对近年来热稳定的α-半乳糖苷酶的应用和基因工程研究进展进行综述。     

新型α-半乳糖苷酶的稳定性研究

目的：观察脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶（GAL）在不同pH缓冲液、不同温度下的稳定性,以及不同离子及还原剂对酶活性的影响。方法：以GAL对单糖底物对硝基-苯基-α-D-吡喃半乳糖苷（PNPG）的活性为主要检测指标,观察不同离子及还原剂等对酶活性的影响;观察GAL在不同pH缓冲液中和不同温度下的稳定性。结果：钙离子、锌离子、钴离子和高浓度的锰离子增强酶的活性,DTT抑制酶的活性,螯合剂EDTA的加入提高了酶活性。GAL在pH4.6～7.5时保存1 h后稳定性很好,能保持最高活性的90％以上;在4℃～45℃下保存的稳定性最好,45℃开始活性下降。结论：GAL具有很好的温度稳定性和pH稳定性,使其适用于血型转变和异种移植。     

结核分枝杆菌磷脂酰肌醇甘露糖苷的研究进展

磷脂酰肌醇甘露糖苷(phosphatidyl-myo-inositol mannoside,PIM)在结核分枝杆菌细胞膜内外含量丰富,靠磷脂酰肌醇(phosphatidyl-myo-inositol,PI)锚定在细胞膜上,并含有1-6个甘露糖和最多4个酰链。PIM不仅是结核分枝杆菌重要的组成物质,也是合成脂甘露聚糖(lipomannan,LM)和脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan,LAM)的结构基础。本文就PIM的合成途径、相关酶、与脂蛋白的关系,及PIM在细菌生理和免疫调节中的作用作一简要综述。     

重组α-半乳糖苷酶的制备工艺研究

α-半乳糖苷酶是B→O血型改造研究中的关键工具酶。在获得了可分泌表达α-半乳糖苷酶的基因工程毕赤酵母菌株的基础上,进行了工程菌株在5L发酵罐中的发酵。发酵液上清中α-半乳糖苷酶活性为80～150U／mL,蛋白浓度为3～4.5mg／mL,比活性约为20-30U／mg。发酵液采用超滤、阳离子交换层析、疏水层析和阴离子交换层析等纯化方法,建立起了规模化生产重组α-半乳糖苷酶的工艺。制备的重组酶纯度经鉴定达98％以上,符合新生物制品的纯度要求。制备的重组α-半乳糖苷酶可有效地将B型红细胞改造成O型红细胞,从而解决了应用此酶开展B→O血型改造研究的关键问题。     

β-木糖苷酶的生物活性物质转化功能研究进展

β-木糖苷酶是木聚糖酶酶系的一种酶,其功能主要是降解半纤维素中最常见及含量最高的组分——木聚糖。近些年,研究人员发现一些微生物来源的β-木糖苷酶具有生物活性物质转化功能,可通过转糖基作用形成带有木糖基的生物活性物质,也可通过水解作用将带有木糖基的物质,如三七皂苷R1和R2、黄芪甲苷IV (astragaloside IV,ASI)、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(7-xylosyl-10-deacetyltaxol,XDT)和花青素转化为生物活性物质,因此,这些β-木糖苷酶在食品和医药等领域具有巨大的潜在应用价值。此外,研究人员揭示了β-木糖苷酶在生物活性物质转化功能方面的一些机制。本文主要介绍了β-木糖苷酶的生物活性物质转化功能、酶来源、家族分类、转化机制及应用,以期为β-木糖苷酶的进一步开发利用提供参考。     

α-半乳糖苷酶清除猪细胞表面的α-Gal抗原

目的:探讨脆弱类杆菌来源的基因重组α-半乳糖苷酶清除猪细胞表面α-Gal抗原的作用。方法:用不同浓度的α-半乳糖苷酶酶解猪红细胞、猪胚肾细胞PK15、猪睾丸细胞ST和原代培养的猪成纤维细胞上的α-Gal抗原,酶解温度为26℃,作用时间为2 h;用25μg/m L的FITC-IB4凝集素标记酶解前后的细胞,采用流式细胞仪检测细胞表面α-Gal抗原的清除率。结果:流式细胞检测结果表明,不同组织来源的猪细胞表面的α-Gal抗原的表达量明显不同,所需酶的剂量也不同,但其表面的α-Gal抗原均能被α-半乳糖苷酶清除。结论:脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶可以清除猪细胞表面的α-Gal抗原,提示该酶对降低异种移植引起的超急性排斥反应有重要意义。     

α-半乳糖苷酶酶解对猕猴红细胞结构功能的影响

目的　观察α 半乳糖苷酶对猕猴类人B抗原的酶解效果 ,探讨α 半乳糖苷酶酶解对猕猴红细胞结构、功能的影响。方法　采用热吸收放散试验从 30只华南猕猴中选取类人ABO血型抗原较强的 2只A型、3只B型猕猴做为实验对象 ,以基因重组的α 半乳糖苷酶体外酶解猕猴类人B型血抗原 ,并回输到A型猕猴体内 ,测定红细胞脆性、自身溶血率、胆固醇、高铁血红蛋白、乙酰胆碱脂酶、ATP等红细胞的结构功能指标。结果　经α 半乳糖苷酶酶解后 ,猕猴红细胞胞膜完整、携氧能力正常 ,酶解后的“通用”型血回输给受体猕猴无任何输血反应发生。结论　α 半乳糖苷酶酶解对于猕猴红细胞的形态、结构、功能无不良影响 ,且在实验动物体内是安全的。     

基因工程α-半乳糖苷酶的制备及其性质研究

在获得可分泌表达α 半乳糖苷酶基因工程毕赤酵母菌株的基础上 ,尝试了基因工程α 半乳糖苷酶在 5L发酵罐中的表达以及从发酵液中纯化α 半乳糖苷酶的研究。在 4L无机盐培养基中接种 0 .4LpPIC9K Gal GS115培养物 ,最终得到 3 .5L发酵液。离心所得上清中总蛋白含量为 2 .1g L。根据发酵液中目的蛋白含量高、杂质少等特点 ,设计了如下的纯化流程 :离心→超滤→阳离子交换层析→脱盐→浓缩。纯化后电泳银染结果呈单一蛋白带 ,总回收率 41%。通过测定米氏常数等生化性质对重组酶进行鉴定后 ,完成了人B型红细胞的酶解实验。结果表明 ,从发酵液中纯化的α 半乳糖苷酶可将B型红细胞改造成O型红细胞。本研究同时在数量和质量上为α 半乳糖苷酶在众多领域的广泛应用奠定了基础。     

基因工程α-半乳糖苷酶的制备及其性质研究

在获得可分泌表达α-半乳糖苷酶基因工程毕赤酵母菌株的基础上,尝试了基因工程α-半乳糖苷酶在5 L发酵罐中的表达以及从发酵液中纯化α-半乳糖苷酶的研究。在4 L无机盐培养基中接种0.4 L pPIC9K-Gal/GS115培养物,最终得到3.5 L发酵液。离心所得上清中总蛋白含量为2.1 g/L。根据发酵液中目的蛋白含量高、杂质少等特点,设计了如下的纯化流程：离心→超滤→阳离子交换层析→脱盐→浓缩。纯化后电泳银染结果呈单一蛋白带,总回收率41%。通过测定米氏常数等生化性质对重组酶进行鉴定后,完成了人B型红细胞的酶解实验。结果表明,从发酵液中纯化的α-半乳糖苷酶可将B型红细胞改造成O型红细胞。本研究同时在数量和质量上为α-半乳糖苷酶在众多领域的广泛应用奠定了基础。     

耐热α-半乳糖苷酶的高效表达及酶学性质初探

[目的]实现耐热α-半乳糖苷酶在毕赤酵母中的高效表达,并初步研究其酶学性质。[方法]克隆来源于埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)的α-半乳糖苷酶基因TEgal,构建p AO815-TEgal重组表达载体,采用DNS法测定其水解活性及酶学性质;通过薄层层析研究其水解底物谱;并构建TEgal基因多拷贝表达框,实现了该基因的高效表达。[结果]TEgal对棉籽糖水解活性最高9. 5 U/m L,最适温度75℃,最适pH值3. 5; Na~+、K~+对TEgal有促进作用,Mg~(2+)、Co~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)、Fe~(2+)、Zn~(2+)均能抑制酶活,多拷贝重组表达菌株活性最高为22. 4 U/m L。[结论]成功构建耐热α-半乳糖苷酶高效表达菌株,通过提升基因剂量将酶活和蛋白含量提高了135%和356%。     

根霉α-半乳糖苷酶的三相分离及其酶学性质

根霉Rhizopus sp. A01发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过三相分离、Sephadex G-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了6.7倍,总酶活回收率达到46%;凝胶过滤和SDS-PAGE显示该酶为相对分子质量为87.6kDa的单体蛋白。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为5.0,最适温度为55℃,表观Km、kcat/Km分别为2.56mmol/L、47,400L/mol·s;能微弱水解蜜二糖和棉子糖,水解蜜二糖的速率是水解棉子糖速率的3.4倍;水解活性受多种     

分枝犁头霉α-半乳糖苷酶的氨基酸组成及化学修饰

α-半乳糖苷酶进行氨基酸组分分析,结果为含有较多的酸性及巯水性氨基酸,较少的组氨酸、酪氨酸及半胱氨酸。 用几种蛋白质侧链修饰试剂对α-半乳糖苷酶进行化学修饰。在一定条件下,当巯基及酪氨酸残基分别被NEM、IAA及NAI修饰后,酶活力不受影响,说明这些基团与活力无关。当羟基、组氨酸及色氨酸残基分别被EDC、DEP、NBS及HNBB修饰后,酶活力大幅度下降,说明这些基团或者参与了酯催化作用或者位于酯活性位区附近。