昆虫激素调节控制的研究——尿素循环问题和保幼激素类似物对精氨酸酶的调节控制

尿素循环在生物体氮化合物代谢和调节控制中起着极为重要的作用。昆虫排出的尿素是否由于存在尿素循环而形成,尚未定论。我们对各种蚕体组织所作的研究表明,不存在尿素全循环,但脂肪体中精氨酸酶活力甚高,该酶与蚕的变态密切相关,并受保幼激素类似物(JHA)的调控。家蚕、蓖麻蚕和柞蚕脂肪体中,除精氨酸酶具有明显活力外,氨基甲酰磷酸合成酶,鸟氨酸转氨甲酰磷酸酶和精氨酸合成酶均无可检出的活力。在蚕幼虫期,尤其在五龄中后期,精氨酸酶活力最高;眠期和蛹期,该酶活力很低;蛹化蛾后,该酶活力又明显增高。用不同剂量的JHAZR515处理家蚕,观察到在适当剂量时,精氨酸酶活力明显地高于对照组,提高范围从30%到110%;当用高剂量ZR515处理蚕后,引起不结茧蚕,精氨酸酶活力先低于对照组,以后再逐步回升并高于对照组,而且持续增高的时间也较长。这表明蚕的变态和精氨酸酶活力的变化与JHA的量密切相关联并受JHA的调节控制。     

昆虫激素调节控制的研究——保幼激素类似物对合成甘氨酸和丙氨酸有关酶系的调节控制

五龄后期蚕丝腺后部的细胞几乎只合成蚕丝的丝心蛋白。保幼激素类似物(JHA)能增加蚕丝心蛋白的生物合成。家蚕和蓖麻蚕丝心蛋白中,甘氨酸和丙氨酸的含量约占75%。我们用ZR515和ZR777分别处理五龄蚕后,观察到丝腺后部和脂肪体中合成甘氨酸和丙氨酸有关转氨酶的活力均有明显增加。(1)用ZR515处理五龄家蚕后,使五龄期延长1～2天,茧层量增加约10%。蚕丝腺后部的丙氨酸-乙醛酸转氨酶,丙氨酸-酮丙二酸转氨酶,谷丙转氨酶和谷天转氨酶活力,JHA 组均比对照组增高约10～40%,脂肪体中这些酶活力也相应地比对照组增高约30%,其中丙氨酸-乙醛酸转氨酶活力增加到165%。酶活力增加的持续时间约3～5天。(2)用ZR777处理五龄蓖麻蚕后,丝腺后部和脂肪体中的谷天转氨酶、异亮氨酸-α-酮戊二酸转氨酶和丙氨酸-乙醛酸转氨酶活力,均比对照组高。本文认为JHA 对蚕丝腺后部和脂肪体中形成甘氨酸和丙氨酸的转氮酶有明显的调控作用,从而为丝心蛋白的合成提供更多的甘氨酸和丙氨酸。这也许是JHA 增丝机制的一个重要方面。     

昆虫激素调节控制的研究——保幼激素类似物对合成甘氨酸和丙氨酸有关酶系的调节控制

五龄后期蚕丝腺后部的细胞几乎只合成蚕丝的丝心蛋白。保幼激素类似物(JHA)能增加蚕丝心蛋白的生物合成。家蚕和蓖麻蚕丝心蛋白中,甘氨酸和丙氨酸的含量约占75%。我们用ZR515和ZR777分别处理五龄蚕后,观察到丝腺后部和脂肪体中合成甘氨酸和丙氨酸有关转氨酶的活力均有明显增加。(1)用ZR515处理五龄家蚕后,使五龄期延长1～2天,茧层量增加约10%。蚕丝腺后部的丙氨酸-乙醛酸转氨酶,丙氨酸-酮丙二酸转氨酶,谷丙转氨酶和谷天转氨酶活力,JHA组均比对照组增高约10～40%,脂肪体中这些酶活力也相应地比对照组增高约30%,其中丙氨酸-乙醛酸转氨酶活力增加到165%。酶活力增加的持续时间约3～5天。(2)用ZR777处理五龄蓖麻蚕后,丝腺后部和脂肪体中的谷天转氨酶、异亮氨酸吨-α-酮戊二酸转氨酶和丙氨酸-乙醛酸转氨酶活力,均比对照组高。本文认为JHA对蚕丝腺后部和脂肪体中形成甘氨酸和丙氨酸的转氨酶有明显的调控作用,从而为丝心蛋白的合成提供更多的甘氨酸和丙氨酸。这也许是JHA增丝机制的一个重要方面。     

昆虫激素调节控制的研究——保幼激素类似物对蓖麻蚕精氨酸酶的诱导以及对脂肪体超微结构的影响

昆虫精氨酸酶是一个与精氨酸分解代谢、能量代谢以及尿素排泄有关的重要酶。在蓖麻蚕的个体发育过程中,其活力有明显的变化规律,在四龄眠期,保幼激素类似物(JHA)对蓖麻蚕脂肪体的精氨酸酶有明显的诱导作用,放线菌素D 对该酶的诱导有抑制作用,并与JHA 相撷抗。五龄中期,JHA 能使该酶持续维持在活力较高的水平。另外,JHA 对鸟氨酸-δ转氨酶和△~1-吡咯烷-5-羧酸还原酶也有调节作用,自精氨酸到脯氨酸途径的中间产物及最终产物都对精氨酸酶有反馈抑制。JHA 能促使四龄眠期蓖麻蚕脂肪体细胞中大型液泡、核糖体、脂肪颗粒增多。     

保幼激素类似物和β-蜕皮素对蓖麻蚕氮代谢产物排泄的影响

精氨酸酶是昆虫体内重要的酶;尿素是精氨酸分解代谢的产物,它的排出量反映了精氨酸酶的活力。在蓖麻蚕五龄幼虫的排泄物中尿素的量为从蓖麻叶中摄取尿素总量的14.7倍。外源激素影响精氨酸酶的活性。对四龄眠期、五龄二天的幼虫注射保幼激素类似物(JHA)ZR-515,使排泄物中尿素含量增加,特别是五龄二天注射JHA后,到五龄六天幼虫排尿素量增高了45%。此外,虫体注射JHA和β-蜕皮素(MH)后,排泄物除尿素外,尿酸和氨的含量也发生有规律的变化。     

家蚕中的5-氧脯氨酸酶及保幼激素类似物对它的影响

本工作首次在家蚕Bombyx mori的马氏管、中肠、丝腺及脂肪体等组织中测到了γ-谷氨酰循环中一个关键酶——5-L-氧脯氨酸酶的活力.该酶以马氏管中活力最高,在蚕的中肠、血淋巴中均存在有游离的5-氧脯氨酸.观察了保幼激素类似物(JHA)处理后,家蚕中肠、丝腺和脂肪体中5-L-氧脯氨酸酶活力的变化,同时观察了血淋巴中5-氧脯氨酸含量的变化.对该酶及γ-谷氨酰循环在蚕体中氨基酸转运上的可能作用进行了讨论.     

家蚕中的5-氧脯氨酸酶及保幼激素类似物对它的影响

本工作首次在家蚕Bombyx mori的马氏管、中肠、丝腺及脂肪体等组织中测到了γ-谷氨酰循环中一个关键酶——5-L-氧脯氨酸酶的活力.该酶以马氏管中活力最高,在蚕的中肠、血淋巴中均存在有游离的5-氧脯氨酸.观察了保幼激素类似物(JHA)处理后,家蚕中肠、丝腺和脂肪体中5-L-氧脯氨酸酶活力的变化,同时观察了血淋巴中5-氧脯氨酸含量的变化.对该酶及γ-谷氨酰循环在蚕体中氨基酸转运上的可能作用进行了讨论.     

昆虫激素调节控制的研究——保幼激素类似物和β-蜕皮素对酪氨酸转氨酶和多酚氧化酶的调节控制

本文报道了鳞翅目天蚕蛾科蓖麻蚕的酪氨酸转氨酶和多酚氧化酶的变化以及昆虫激素对这两个酶的调节控制。作者观察到蓖麻蚕自四龄眠至五龄后期的活力有明显的变化规律,保幼激素类似物ZR-515和β-蜕皮素对该酶有诱导作用。此外,我们还观察到四龄眠期和五龄期间保幼激素类似物ZR-515和β-蜕皮素对多酚氧化酶也有明显的调节控制作用。     

昆虫激素调节控制的研究——保幼激素类似物和β-蜕皮素对酪氨酸转氨酶和多酚氧化酶的调节控制

本文报道了鳞翅目天蚕蛾科蓖麻蚕的酪氨酸转氨酶和多酚氧化酶的变化以及昆虫激素对这两个酶的调节控制。作者观察到蓖麻蚕自四龄眠至五龄后期的活力有明显的变化规律,保幼激素类似物ZR-515和β-蜕皮素对该酶有诱导作用。此外,我们还观察到四龄眠期和五龄期间保幼激素类似物ZR-515和β-蜕皮素对多酚氧化酶也有明显的调节控制作用。     

β-蜕皮素对家蚕丝腺成长及合成甘氨酸、丙氨酸有关酶系的调节控制

本文研究了植源性β-蜕皮素(简称MH)对家蚕丝腺成长及合成甘氨酸、丙氨酸有关酶系的影响,探讨了5龄不同时期添食β-蜕皮素后丝腺体的成长及后部丝腺和脂肪体中丙氨酸-酮丙二酸、丙氨酸-乙醛酸和鸟氨酸转氨酶活力的变化。通过实验观察到:(1)5龄早期(饷食)添食β-蜕皮素,龄期延长8—9小时,茧层量增加,后部丝腺和脂肪体内丙氨酸-酮丙二酸转氨酶、丙氨酸-乙醛酸转氨酶在处理后6-12小时内,比对照组增高40—50%。随之酶活力略下降,至5龄后期复又升高,明显超过对照组。脂肪体中鸟氨酸转氨酶在β-蜕皮素处理后6小时和48小时均低于对照组。12—24小时以及48小时后直至老熟则明显高于对照组。(2)5龄后期(V—136小时)口腔注射β-蜕皮素,龄期缩短12—18小时。脂肪体和丝腺体中丙氨酸-酮丙二酸转氨酶、丙氨酸-乙醛酸转氨酶活力明显高于对照组(一般增高20—40%),老熟时迅速下降。本文对有关保幼激素和β-蜕皮素对5龄家蚕两种靶细胞(丝腺细胞和脂肪细胞)的相互配合和制约以完成对蚕整体的调节控制,以及这两种昆虫激素应用于蚕业生产以控制5龄期的长短和增加蚕丝产量等方面进行了讨论。     

蓖麻蚕和家蚕中的谷胱甘肽及正丁基高半胱氨酸亚砜亚胺对它的抑制作用

本文利用乙醛酸排除昆虫中比较高的游离半胱氨酸的干扰,用5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)方法测定了蓖麻蚕、家蚕中还原谷胱甘肽的含量及其组织分布,观察到脂肪体、后部丝腺、中肠等均含有非常丰富的谷胱甘肽(GSH),说明谷胱甘肽在昆虫氨基酸的代谢调节控制中起着重要的作用。蓖麻蚕和家蚕中,GSH含量及分布有所区别。五龄中期注射S-正丁基高半胱氨酸亚砜亚胺(BSO)引起家蚕脂肪体GSH含量明显降低,提示蚕γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶受RSO强烈抑制;五龄后期,可能由于合成酶活力及GSH周转率均处于较低水平,未观察到GSH含量有明显下降。     

蓖麻蚕在变态期间代谢作用的研究——Ⅲ.酸性磷酸一酯酶的性质及其活力在变态期的变化

蓖麻蚕在变态期血淋巴酸性磷酸一酯酶活力随着蚕体的发育不断发生变化。在五龄起蚕,五龄四天及前蛹期酶活力较高,化蛹时显著降低,羽化前后又复升高。酶活力按血淋巴单位体积计算。雌雄两性差异不显著。但由于五龄中期以后,血淋巴蛋白质含量雌体大于雄体:故自五龄中期以后,酶的比活力雄体大于雌体。此酶在组织中的分布及其活力变化如下:在幼虫五龄盛食期消化道酶活力较高,其中尤以中肠酶活力最高。脂肪体和丝腺仅有微弱的酶活力。脂肪体酶活力有蛹期上升,羽化后达到最高点。此表明蓖麻蚕中肠在五龄盛食期具有旺盛的磷酸化及脱磷酸化作用,为代谢的活跃场所。在蛹及成虫体,消化道退化,脂肪体在代谢方面占了主要位置。昆虫血淋巴和其它动物血液不同的一个方面是它含有大量的磷酸酯类。影响血淋巴磷酸酯类的种类及其含量变化的,主要有两个因素:一是血淋巴本身对于不同的磷酸酸类的选择水解,蓖麻蚕在变态期血淋巴不同专一性磷酸酯酶的存在及其活力的变化,就是血淋巴选择水解的决定因素:另一是组织磷酸酯类对于血淋巴的选择分泌;本研究表明五龄幼虫中肠及脂肪体,尤其是蛹和成虫的脂肪体是血淋巴磷酸酯的重要来源。此外还研究了血淋巴磷酸一酯酶的性质,及某些金属离子,有机酸等对该酶活力的抑制及激活作用。     

尿素对热带假丝酵母Candida tropicalis合成长链二元酸途径的调节 Ⅱ.几个关键酶活力的消长

前文已报道尿素及尿素结构类似物对长链二元酸的合成酶系既有抑制作用,也有阻遏作用,从而调节了长链二元酸的合成。本文进一步从离体酶系探索过量尿素对热带假丝酵母在烃类氧化过程中有关三羧酸循环,乙醛酸循环,呼吸链,ω和β氧化等几个关键酶活力的消长关系。实验结果证明,过量尿素(0.2%)以上培养菌体的三羧酸循环三个主要脱氢酶,苹果酸脱氢酶,琥珀酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶(NADP)的比活力分别为正常尿素(0.1%)培养菌体的5.3、3.0、1.7倍。乙醛酸循环关键酶,异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶分别为正常尿素培养物的2.6和2.8倍。另一方面当尿素过量时ω-氧化酶系活力极微,而β-氧化酶系活力大大提高,以致长链二元酸难以积累。另外过氧化氢酶活力在过量尿素存在时也有显著提高。而谷氨酸脱氢酶、NADH氧化酶和由NAD连结的异柠檬酸脱氢酶在两种菌体内无明显差别。     

尿素对热带假丝酵母Candida tropicalis合成长链二元酸途径的调节——Ⅱ.几个关键酶活力的消长

前文已报道尿素及尿素结构类似物对长链二元酸的合成酶系既有抑制作用,也有阻遏作用,从而调节了长链二元酸的合成。本文进一步从离体酶系探索过量尿素对热带假丝酵母在烃类氧化过程中有关三羧酸循环,乙醛酸循环,呼吸链,ω和β氧化等几个关键酶活力的消长关系。实验结果证明,过量尿素(0.2%)以上培养菌体的三羧酸循环三个主要脱氢酶,苹果酸脱氢酶,琥珀酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶(NADP)的比活力分别为正常尿素(0.1%)培养菌体的5.3、3.0、1.7倍。乙醛酸循环关键酶,异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶分别为正常尿素培养物的2.6和2.8倍。另一方面当尿素过量时ω-氧化酶系活力极微,而β-氧化酶系活力大大提高,以致长链二元酸难以积累。另外过氧化氢酶活力在过量尿素存在时也有显著提高。而谷氨酸脱氢酶、NADH氧化酶和由NAD连结的异柠檬酸脱氢酶在两种菌体内无明显差别。     

家蚕血液过氧化氢酶活力及其与蚕体抗逆性的关系

家蚕召Bombyx mori(L.)血液过氧化氢酶(CAT)活力随发育时期呈现有规律的动态变化。在幼虫期,CAT活力以龄初、龄末较高,而龄中较低;化蛹后,CAT活力迅速上升,至中期达到峰值,随后迅速下降直至羽化。不同性别间CAT活力均以雄性较高;不同蚕品种间CAT活力有很大差异;饲料对CAT活力有一定影响,人工饲料育蚕CAT活力略大于桑叶育的;高温冲击和氟化物添食都能引起CAT活力的显著变化,但变化的幅度因品种、性别、时期和添食剂量而有所不同。研究认为,家蚕血液CAT活力与其发育变态、体内代谢均具有密切关系,逆境条件下CAT活力变化幅度的大小可以作为家蚕抗逆性强弱的一个重要生理指标。     

蚕氨基酸代謝之研究——Ⅵ.家蚕与蓖麻蚕的谷氨酸脫氫酶

在家蚕与蓖痲蚕的脂肪体,絲腺后部和中腸組織中,利用分光光度法,都观察到谷氨酸脫氫酶。将α-酮戊二酸与NH_4~+加于以上各种組織的酶液中,測定NADH_2的氧化,証实了其逆向反应的存在。蚕組織中的谷氨酸脫氫酶需要NAD为其輔酶。在家蚕与蓖痲蚕的絲腺后部中,我們利用直接測定的方法,观察到БраунШтеЙн所提出的轉氨-脫氨作用的存在,从而进一步說明谷氨酸脫氫酶在氨基酸代謝中的重要地位。此外,我們尚发現在不同发育阶段,蓖麻蚕脂肪体中谷氨酸脫氫酶的活力表現显著的变化。     

蜕皮激素对家蚕卵黄原蛋白基因表达的调控

蜕皮激素（20-hydroxy ecdysone,20E）是由前胸腺分泌的能调节节肢动物昆虫纲、甲壳纲等动物蜕皮的激素. 家蚕属于完全变态昆虫,一生经历卵、幼虫、蛹、成虫四个发育时期. 20E在家蚕发育过程中有不可替代的作用. 本研究通过酶联免疫吸附反应（ELISA）测定家蚕变态期前后血淋巴中20E滴度,发现在卵黄原蛋白基因 (Bombyx mori vitellogenin, BmVg) 高量表达前的雌雄血淋巴中20E含量没有明显差异,但含量变化趋势与BmVg表达趋势相一致. 用20E注射上蔟后60 h的家蚕和添食5龄家蚕, 能诱导雌性和雄性脂肪体中BmVg表达和蛋白合成. 调查处理后的家蚕所产卵中的卵黄磷蛋白（BmVn）含量及重量,发现蚕卵中BmVn含量及蚕卵重量都明显增加|本研究还通过脂肪体体外培养,证明了20E是直接作用于脂肪体来诱导BmVg的表达. 本研究结果表明,20E是通过诱导脂肪体中BmVg的转录来增加蚕卵中BmVn积累,从而最终使得蚕卵重量也相应增加.     

蓖麻蚕芳基酰酰胺酶的研究

芳基酰酰胺酶(E.C.3,5,1,13)为水解N-酰基芳香胺的酶,本工作对该酶在蓖麻蚕个体发育中的活力变化及其性质进行了观察和研究,结果如下:ⅰ)该酶存在于蚕个体发育中的各个阶段,广泛分布在蚕体内各组织。在中肠、马氏管组织的活力在熟蚕时最大,结茧后明显下降。在五龄中前期,蛹中后期,脂肪体和真皮的酶活力均出现高峰,以蛹中后期活力最高。该酶在中枢神经系统中有相当高的活力,在后部丝腺、蚕卵都显示活力,但血淋巴中没有可检出的活力。ⅱ)蓖麻蚕各组织的芳基酰酰胺酶,绝大部分活力存在于细胞浆。对N-乙酰对硝基苯胺容易水解,但对γ-谷氨酰对硝基苯胺和γ-谷氨酰α-萘胺均不能水解。钙、钴阳离子能促进酶活力;瞟呤霉素有明显抑制酶活力的作用,但L-γ-谷氨酸(0-羧基)苯肼无抑制作用。从该酶在蚕体广泛分布,并随变态而活力有明显变化以及对底物芳香胺N-乙酰基团显示特异性等特点来看,它可能具有多种功能,并与芳香胺的代谢有关。     

家蚕幼虫-蛹变态期前胸腺和脂肪体细胞解离和程序性细胞死亡的比较分析

【目的】检测家蚕Bombyx mori变态期前胸腺细胞的解离、自噬与凋亡,并与脂肪体的进行对比,从而解析昆虫幼虫-蛹变态期过程中不同组织重塑的异同。【方法】以家蚕5龄期、游走期、预蛹期和蛹期前胸腺和脂肪体组织为材料,在光学显微镜下观察前胸腺和脂肪体细胞解离情况;分别利用Lyso-Tracker和TUNEL染色,在荧光共聚焦显微镜下观察细胞自噬和细胞凋亡的发生情况;利用qRT-PCR检测家蚕前胸腺中自噬发生标志基因Atg8的表达水平;利用透射电镜观察前胸腺和脂肪体细胞自噬小体和前胸腺线粒体;利用Caspase3酶活性检测试剂盒测定Caspase3酶活性;利用qRT-PCR检测前胸腺中蜕皮酮(ecdysone)合成相关基因Spo,Phm,Dib和Sad的表达水平;利用酶免疫试验(enzyme-immunoassay, EIA)测定前胸腺中蜕皮酮的含量,进而检测合成蜕皮酮的活力。【结果】在家蚕幼虫到蛹的变态发育过程中,在化蛹第1天家蚕前胸腺和脂肪体细胞中同时开始出现细胞解离;脂肪体细胞自噬和凋亡分别在游走期和预蛹第1天开始出现并逐渐增强;而前胸腺一直到化蛹第2天都没有发生明显的细胞自噬和凋亡;此外,前胸腺中线粒体的形态变化和蜕皮酮合成相关基因的转录水平均与对应时期前胸腺合成蜕皮酮的活力一致。【结论】在变态发育时家蚕不同组织消亡发生的时间不同,虽然前胸腺和脂肪体在化蛹第1天同时出现细胞解离,但是前胸腺直到化蛹第2天都不发生细胞自噬和凋亡,可能与其持续合成蜕皮酮的功能有关。本研究为昆虫幼虫-蛹变态发育时期组织消亡的深入研究提供了理论依据与工作基础。     

摄入异烟肼对家蚕幼虫体内谷胱甘肽氧化还原循环和谷胱甘肽S-转移酶活性的影响

为了建立家蚕Bombyx mori的药物筛选和毒性评价模型, 以剂量为2 000 mg/kg的抗结核模药异烟肼饲喂家蚕5龄第3天幼虫后检测其中肠和脂肪体的抗氧化解毒相关代谢的变化。结果表明： 雌蚕中肠组织中, 总谷胱甘肽(GSH+2GSSG)、 还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione, GSSG)含量均呈现迅速上升再缓慢下降趋势; 谷胱甘肽S 转移酶(glutathione S-transferase, GST)活性升高到较大值后逐渐降低; GSH/GSSG的比值下降表明, 在72 min后中肠组织向氧化态转移。脂肪体组织中, 总谷胱甘肽、 GSH和GSSG含量变化均呈现迅速下降再迅速上升的趋势; GST活性达到最大值后逐渐降低后趋于平稳; GSH/GSSG比值升高表明, 在72 min后脂肪体组织向还原态转移。无论雌蚕还是雄蚕, 总谷胱甘肽、 GSH和GSSG含量以及GST活性均是脂肪体高于中肠。雌蚕的总谷胱甘肽含量、 GSH和GSSG含量高于雄蚕, 但雄蚕的GST活性高于雌性。结果说明, 摄入异烟肼引起了家蚕幼虫体内谷胱甘肽氧化还原状态的改变和酶活性的变化, 在这个过程中脂肪体起主要解毒代谢作用。